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载体质粒的双酶切 已有3人参与
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我做的是Pcu19质粒的双酶切，酶切体系如下：质粒10μL，10×H Buffer 4μL，ddH2O2 22μL ，SaL I 2μL，EcoRI 2μL。另一管质粒的量为20微升恩，其中水的量变为12微升，其他的不变。 然后将其放入37度恒温培养箱培养3h，再在80摄氏度使酶失活，最后进行电泳检测。图片如下：从下往上看一次点的是：Marker，对照空载体，酶切之后的两个产物。 为什么酶切之后的条带比空载体的条带大呢？？我试过好多个体系，但没有一个酶切成功，请各位虫友帮帮忙！  发自小木虫Android客户端 |
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2楼2015-11-29 17:01:02
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图没看清，如果说切出来变得比超螺旋大的话很有可能是你的酶切是个单酶切，也就是其中一种酶没有发挥效用……如果两个酶的最适buffer不同的话，你可以两步酶切 发自小木虫Android客户端 |
5楼2015-11-30 00:14:55
吗子
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13楼2015-12-02 08:58:54
3楼2015-11-29 22:06:08
4楼2015-11-29 22:06:48
6楼2015-11-30 08:20:51
7楼2015-11-30 18:06:44
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可是酶切之后的质粒载体比没有酶切过的质粒载体还要大没道理啊，应该是环状的比线状的大吧。还有我的目的片段是850bp的，载体是大于2000bp的，如果连接上了应该不会只比酶切的大一点点吧？ 发自小木虫Android客户端 |
8楼2015-12-01 08:28:16
【答案】应助回帖
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
郑凤席: 金币+2, ★★★很有帮助, 不知为啥他只能给1～2，本来我是要给9的～～ 2015-12-01 14:41:15
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1 环状质粒凝胶电泳一般会出现三种构象：超螺旋，这种迁移速度最快，也是看到最多的；接近线状的，这种构象在凝胶中与酶切后的线状DNA迁移率一致；负超螺旋，这种质粒是开环的，迁移速率最慢，在凝胶中看起来比线状DNA要大。从你的图片来看，你的质粒是被切成线状的了。 2 如果你要纠结没有检测到目的片段，那有一种可能是没有连入目的片段，他也是个空载体；另一种可能是连入目的片段，但没有切下来，这有可能是其中一个酶切位点破坏，或一个没失活；建议你将质粒分别做个单酶切，检测一下位点/酶 是否正常。 |
9楼2015-12-01 11:11:00
10楼2015-12-01 12:22:27