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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR就是不出目的条带！！！！
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寻香海棠

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR就是不出目的条带！！！！ 已有1人参与

我想做基因敲除，准备敲除的下游臂扩出来没有问题。

但是上游臂就是扩不出来。梯度PCR和降落PCR都试了，还是不行。引物设计的是60度的退火温度，软件是Omiga2.0. 引物也重新设计过了，向上增加了100bp左右，还是没有条带

用的菌株不是植物乳杆菌标准株，参考是WCFS1

诸位帮我分析一下！
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人生得意需尽欢
1楼 2015-09-25 22:00:44
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chinaaoju

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以先把引物沸水中煮5min，然后迅速冰浴，有利于打开引物的二级结构；
也可以在反应体系中加DMSO，BSA；
如果模板加的过多也会P 不出来；
目的基因的GC% 是不是太高？
PCR 的退火温度一般是选择引物中退火温度低的那一个再减去5 度来做为PCR 时的退火温度。
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9楼2015-09-26 22:38:03
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wxb2061

银虫 (小有名气)
我是质粒构建，1511的目的片段，p了三回了，都是没有p出来，温度设置50，55，58三回，就是没有目的片段

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走在途中……
2楼2015-09-25 23:20:19
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寻香海棠

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wxb2061 at 2015-09-25 23:20:19
我是质粒构建，1511的目的片段，p了三回了，都是没有p出来，温度设置50，55，58三回，就是没有目的片段

那你怎么解决呢！？

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人生得意需尽欢
3楼2015-09-25 23:25:52
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199006287956

木虫 (著名写手)
这个问题，我遇到过，我选择的第一个方案往往是设计温度梯度进行扩增，48-68度均试过，大部分能出来。但是还是有顽强的，如果结合引物的目的基因位置，自身不是很好和引物结合，判断结合好坏有G值决定的，不能偏低。会导致没有扩增条带，我们往往就是往外或者往里，从新设计引物。往往能批出条带。多设几个不同结合位点的引物，不差钱。

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追求不惜，奋斗不息
4楼2015-09-26 00:28:43
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