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崩溃！！易错pcr重组质粒构建总是失败！！求大神指导！已有3人参与
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小虫做的是酶的定向进化，主要是采用易错pcr技术实施目的片段的随机突变，完了插入表达载体，表达蛋白测定性质。 目前在构建重组载体阶段，可是构建了一个月了就是不成功，老板又在催，心里那个急啊！具体情况是这样的- 载体是我们实验室事先构建好的pet-28a，含有目的片段，我要做的就是先用易错pcr把目的片段p出来，主要是通过改变pcr体系中的各组分比例和浓度，然后纯化，在和同样的载体经过双酶切，连接，转化。具体的体系: 双酶切 用的是thermo scientic 的Nhel和Xhol，这两种酶在同一缓冲液中活性不同，xhol在最适Nhel缓冲液中最大活性只有50％，我通过加倍用量进行酶切，体系是1ug样品加0.5ulNhel 1ulXhol，酶切5h，经过单双酶切验证，载体是切完全了的。 连接 用的是takara的t4连接酶，体系是按照说明书来的，16 度过夜 酶切后都是经过胶回收的，回收后浓度有50+ 转化 转的DH 设置了感受态空白对照，经酶切胶回收后不加连接酶的空载，和连接产物转化，转化全部连接液25ul，操作没问题，以前做正常质粒都是成功的，结果是感受态长得好，空载不长，连接产物有时长很多单克隆，有时就一两个，经菌落pcr验证全是假阳性，每个板挑了10个克隆。菌落pcr技术没问题。 问题: 空载没长，说明几乎没有载体自连，实验板长了有两种情况:1 连接成功，那菌落pcr应有条带 2 连接不成功，载体又没有自连，那哪来的克隆？？ 好吧，就算不考虑空载对照，就算酶切不彻底，出现单酶切，载体自连了，但是我的载体本身是含有正常目的片段的啊，那应该p的出来啊？？尽管没有插入我需要的错误片段。 为啥又出现克隆，又p不出条带呢？？？整不明白？ 求各位大神指导哇，感激不尽！！！ [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ] [ Last edited by richard0820 on 2014-7-14 at 14:09 ] |
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