应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 崩溃！！易错pcr重组质粒构建总是失败！！求大神指导！
51/1返回列表
查看: 3368  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

richard0820

铜虫 (初入文坛)

[求助] 崩溃！！易错pcr重组质粒构建总是失败！！求大神指导！ 已有3人参与

小虫做的是酶的定向进化，主要是采用易错pcr技术实施目的片段的随机突变，完了插入表达载体，表达蛋白测定性质。
    目前在构建重组载体阶段，可是构建了一个月了就是不成功，老板又在催，心里那个急啊！具体情况是这样的-
    载体是我们实验室事先构建好的pet-28a，含有目的片段，我要做的就是先用易错pcr把目的片段p出来，主要是通过改变pcr体系中的各组分比例和浓度，然后纯化，在和同样的载体经过双酶切，连接，转化。具体的体系:
双酶切  用的是thermo scientic 的Nhel和Xhol，这两种酶在同一缓冲液中活性不同，xhol在最适Nhel缓冲液中最大活性只有50％，我通过加倍用量进行酶切，体系是1ug样品加0.5ulNhel  1ulXhol，酶切5h，经过单双酶切验证，载体是切完全了的。
连接   用的是takara的t4连接酶，体系是按照说明书来的，16 度过夜
酶切后都是经过胶回收的，回收后浓度有50+
转化  转的DH 设置了感受态空白对照，经酶切胶回收后不加连接酶的空载，和连接产物转化，转化全部连接液25ul，操作没问题，以前做正常质粒都是成功的，结果是感受态长得好，空载不长，连接产物有时长很多单克隆，有时就一两个，经菌落pcr验证全是假阳性，每个板挑了10个克隆。菌落pcr技术没问题。
     问题:  空载没长，说明几乎没有载体自连，实验板长了有两种情况:1  连接成功，那菌落pcr应有条带
2  连接不成功，载体又没有自连，那哪来的克隆？？
好吧，就算不考虑空载对照，就算酶切不彻底，出现单酶切，载体自连了，但是我的载体本身是含有正常目的片段的啊，那应该p的出来啊？？尽管没有插入我需要的错误片段。
为啥又出现克隆，又p不出条带呢？？？整不明白？
  求各位大神指导哇，感激不尽！！！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]

[ Last edited by richard0820 on 2014-7-14 at 14:09 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-07-07 18:05:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

L秋爱学习

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by janjanjanjan at 2015-10-08 10:32:43
我的也是，感觉空载好多，现在解决了么？

我现在做也是 请问前辈是怎么解决的呀 有找到假阳性的原因吗

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
8楼2017-11-19 10:34:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答

厚德求是

木虫 (著名写手)

Ph. D. Prof.

【答案】应助回帖

★ ★
richard0820(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-10-30 19:23:05
有点不明白你说的“结果是感受态长得好，空载不长，连接产物有时长很多单克隆，有时就一两个”，意思是说感受态空白对照长了，加切胶回收但不连接的没长，然后加链接产物长得时好时坏？我猜想是不是你的板子的抗性出了问题，并且使用的感受态细胞液有问题。有重复过试验吗？每次i都是这样？
赞一下 回复此楼
2楼2014-08-10 13:59:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

neer

铁虫 (初入文坛)
你问题解决了吗？我也遇到类似问题，快愁死了
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2014-10-30 17:07:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

淘七九懒

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

你可以尝试用一步克隆法，很好做，效率也很高！
赞一下 回复此楼
4楼2015-09-06 11:03:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 不应该看fileCode +6 且听虎啸 2026-08-12 8/400 2026-08-13 12:07 by 小木虫6752397
[基金申请] FileCode能看出啥？ +8 要乐观耀哥 2026-08-10 26/1300 2026-08-13 12:01 by Tide man
[基金申请] 关于Filecode分析方法 +9 majunge000 2026-08-10 11/550 2026-08-13 10:40 by ZH远山
[基金申请] 我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人 +9 家与远方 2026-08-10 14/700 2026-08-13 09:41 by 臭臭不臭01
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +22 Lanmanbaby 2026-08-09 36/1800 2026-08-12 22:50 by sdfapple719
[基金申请] 好奇怪的filecode +5 布布和一二 2026-08-08 6/300 2026-08-12 16:11 by 云上清扬
[基金申请] filecode +13 documentary 2026-08-10 15/750 2026-08-12 15:56 by 云上清扬
[基金申请] 奇怪，两个人的filecode固定段从头到尾一模一样 +7 布布和一二 2026-08-10 10/500 2026-08-12 09:12 by 布布和一二
[基金申请] 综述论文作为代表作会不会影响评审专家的印象分？ +11 yufeiwaner 2026-08-09 13/650 2026-08-12 08:17 by yufeiwaner
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +3 yuleib84 2026-08-11 3/150 2026-08-11 21:53 by jnhyjjm
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +3 majunge000 2026-08-11 4/200 2026-08-11 20:13 by lch2012
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:25 by Tide man
[基金申请] 基金中了 +15 laoda193707 2026-08-06 15/750 2026-08-11 00:11 by jiafei2190
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
[基金申请] 2026国自然放榜时间 +9 布布和一二 2026-08-08 9/450 2026-08-10 11:22 by xxxx2020
[基金申请] 这样的filecode谁见过 +11 布布和一二 2026-08-08 22/1100 2026-08-10 11:10 by wmfsnow
[基金申请] fileCode有新解读？ +10 Tide man 2026-08-08 18/900 2026-08-09 12:55 by 仁砚薪传
[基金申请] 关于豆爷回答的JTJC与%2F数量 +5 yang182083 2026-08-06 7/350 2026-08-08 18:29 by zhanghaozhu
[基金申请] 国基金的申报应该改成非等额制，评价高的钱多评价低的钱少，但是增加资助率 +7 a089 2026-08-07 7/350 2026-08-08 18:05 by gltch
[基金申请] 固定端突然变了，今天 +6 archvillain 2026-08-06 10/500 2026-08-07 16:03 by 医学老男孩
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭