| 查看: 3011 | 回复: 8 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
崩溃！！易错pcr重组质粒构建总是失败！！求大神指导！ 已有3人参与
|
||
|
小虫做的是酶的定向进化，主要是采用易错pcr技术实施目的片段的随机突变，完了插入表达载体，表达蛋白测定性质。 目前在构建重组载体阶段，可是构建了一个月了就是不成功，老板又在催，心里那个急啊！具体情况是这样的- 载体是我们实验室事先构建好的pet-28a，含有目的片段，我要做的就是先用易错pcr把目的片段p出来，主要是通过改变pcr体系中的各组分比例和浓度，然后纯化，在和同样的载体经过双酶切，连接，转化。具体的体系: 双酶切 用的是thermo scientic 的Nhel和Xhol，这两种酶在同一缓冲液中活性不同，xhol在最适Nhel缓冲液中最大活性只有50％，我通过加倍用量进行酶切，体系是1ug样品加0.5ulNhel 1ulXhol，酶切5h，经过单双酶切验证，载体是切完全了的。 连接 用的是takara的t4连接酶，体系是按照说明书来的，16 度过夜 酶切后都是经过胶回收的，回收后浓度有50+ 转化 转的DH 设置了感受态空白对照，经酶切胶回收后不加连接酶的空载，和连接产物转化，转化全部连接液25ul，操作没问题，以前做正常质粒都是成功的，结果是感受态长得好，空载不长，连接产物有时长很多单克隆，有时就一两个，经菌落pcr验证全是假阳性，每个板挑了10个克隆。菌落pcr技术没问题。 问题: 空载没长，说明几乎没有载体自连，实验板长了有两种情况:1 连接成功，那菌落pcr应有条带 2 连接不成功，载体又没有自连，那哪来的克隆？？ 好吧，就算不考虑空载对照，就算酶切不彻底，出现单酶切，载体自连了，但是我的载体本身是含有正常目的片段的啊，那应该p的出来啊？？尽管没有插入我需要的错误片段。 为啥又出现克隆，又p不出条带呢？？？整不明白？ 求各位大神指导哇，感激不尽！！！ [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ] [ Last edited by richard0820 on 2014-7-14 at 14:09 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有271人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 质粒，PCR产物双酶切后胶回收不回来？求大神指导！
已经有49人回复
- 质粒构建，挑单菌落验证总是假阳性，求分析原因？！
已经有29人回复
- 重组质粒目的基因PCR
已经有8人回复
- 大神救命！！！菌液PCR 出来酶切质粒没有目的条带
已经有5人回复
- 如何获取目的质粒？
已经有8人回复
- 菌液pcr出来后，质粒提不出，测序老失败？
已经有6人回复
- 【求助/交流】质粒PCR产物的回收（质粒构建）
已经有11人回复
- 【求助/交流】重组质粒PCR的taq酶选择！
已经有11人回复
8楼2017-11-19 10:34:25
厚德求是
木虫 (著名写手)
- 应助: 41 (小学生)
- 金币: 2270.6
- 散金: 1050
- 红花: 3
- 帖子: 1208
- 在线: 107.8小时
- 虫号: 2418606
- 注册: 2013-04-15
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
2楼2014-08-10 13:59:55
3楼2014-10-30 17:07:29
淘七九懒
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 8417.9
- 散金: 101
- 红花: 18
- 帖子: 1017
- 在线: 255小时
- 虫号: 1992869
- 注册: 2012-09-11
- 性别: GG
- 专业: 免疫学研究新技术与新方法
4楼2015-09-06 11:03:52
