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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 崩溃！！易错pcr重组质粒构建总是失败！！求大神指导！
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richard0820

铜虫 (初入文坛)

[求助] 崩溃！！易错pcr重组质粒构建总是失败！！求大神指导！ 已有3人参与

小虫做的是酶的定向进化，主要是采用易错pcr技术实施目的片段的随机突变，完了插入表达载体，表达蛋白测定性质。
    目前在构建重组载体阶段，可是构建了一个月了就是不成功，老板又在催，心里那个急啊！具体情况是这样的-
    载体是我们实验室事先构建好的pet-28a，含有目的片段，我要做的就是先用易错pcr把目的片段p出来，主要是通过改变pcr体系中的各组分比例和浓度，然后纯化，在和同样的载体经过双酶切，连接，转化。具体的体系:
双酶切  用的是thermo scientic 的Nhel和Xhol，这两种酶在同一缓冲液中活性不同，xhol在最适Nhel缓冲液中最大活性只有50％，我通过加倍用量进行酶切，体系是1ug样品加0.5ulNhel  1ulXhol，酶切5h，经过单双酶切验证，载体是切完全了的。
连接   用的是takara的t4连接酶，体系是按照说明书来的，16 度过夜
酶切后都是经过胶回收的，回收后浓度有50+
转化  转的DH 设置了感受态空白对照，经酶切胶回收后不加连接酶的空载，和连接产物转化，转化全部连接液25ul，操作没问题，以前做正常质粒都是成功的，结果是感受态长得好，空载不长，连接产物有时长很多单克隆，有时就一两个，经菌落pcr验证全是假阳性，每个板挑了10个克隆。菌落pcr技术没问题。
     问题:  空载没长，说明几乎没有载体自连，实验板长了有两种情况:1  连接成功，那菌落pcr应有条带
2  连接不成功，载体又没有自连，那哪来的克隆？？
好吧，就算不考虑空载对照，就算酶切不彻底，出现单酶切，载体自连了，但是我的载体本身是含有正常目的片段的啊，那应该p的出来啊？？尽管没有插入我需要的错误片段。
为啥又出现克隆，又p不出条带呢？？？整不明白？
  求各位大神指导哇，感激不尽！！！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]

[ Last edited by richard0820 on 2014-7-14 at 14:09 ]
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1楼 2014-07-07 18:05:43
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janjanjanjan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 淘七九懒 at 2015-09-06 11:03:52
你可以尝试用一步克隆法，很好做，效率也很高！

诺唯赞的一步克隆么，我在用，我们实验室有的人做，阳性长了好多，我的长的少不说，假阳性也很多，这方面的问题你遇到过么

发自小木虫Android客户端
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6楼2015-10-08 10:34:48
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厚德求是

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
richard0820(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-10-30 19:23:05
有点不明白你说的“结果是感受态长得好，空载不长，连接产物有时长很多单克隆，有时就一两个”，意思是说感受态空白对照长了，加切胶回收但不连接的没长，然后加链接产物长得时好时坏？我猜想是不是你的板子的抗性出了问题，并且使用的感受态细胞液有问题。有重复过试验吗？每次i都是这样？
赞一下 回复此楼
2楼2014-08-10 13:59:55
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neer

铁虫 (初入文坛)
你问题解决了吗？我也遇到类似问题，快愁死了
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2014-10-30 17:07:29
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淘七九懒

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

你可以尝试用一步克隆法，很好做，效率也很高！
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4楼2015-09-06 11:03:52
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