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DerekSun

新虫 (初入文坛)

[求助] 有没有熟悉gateway cloning的大牛,想不通,求解释啊!已有5人参与

最近老师叫我用gateway做某基因完整片段的重组和表达,我做了三个月了,BP反应还没搞定,天天挨骂。
详细说一下背景,目的基因大约3Kb,上游有promoter,然后接一个400Kb左右的CDS区,因为做的两步法,所以attB引物加了adapter,引物设计了两对,分别是从promoter前开始到stop codon的(3K左右),还有仅仅CDS区域的。(当然,为了测序验证,3KB中又分步设计了很多引物)。BP的载体用的gateway入门载体pDnor201,转化的大肠杆菌DH5α。
接上attB引物后,做了电泳验证,在3K和500bp的地方都有条带,所以到此应该没问题。
接下来就问题不断了,首先我BP反应后转入菌,培养后涂平板,发现不长菌。
然后我将BP反应时间从1h延长到shake3h,结果有足够的菌了。
可是随机挑了4处菌,做colony PCR,结果电泳后都没有条带。硬着头皮做了一个sample并拿去测序,什么也没测出来。
那么问题就来了。。。
照理说gateway 控制假阳性效果是非常好的,因为我转进去的话,载体中的ccdm毒蛋白基因一定被置换出来了,则空载体不能生存,而且平板是Kanamycin的,所以杂菌应该不会长。那么培养出来的菌落一定是对的才是啊,可为什么做了四个colony PCR结果都跑不出目的片段呢。
现在非常纠结,老师就是坚信我技术不行,我也不知道我错哪了。奉上四张图,分别是长出的菌落,还有四个colonyPCR电泳的结果,以及备份这四个的mass plate。
请有经验的人帮我分析下原因和下一步怎么做好。有没有熟悉gateway cloning的大牛,想不通,求解释啊!
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有没有熟悉gateway cloning的大牛,想不通,求解释啊!-1
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有没有熟悉gateway cloning的大牛,想不通,求解释啊!-2
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zshw_001

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
感觉送测前的菌是受污染的杂菌,要不咋没带。
永远相信未知的总是美好的!
2楼2015-02-05 16:14:49
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DerekSun

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zshw_001 at 2015-02-05 16:14:49
感觉送测前的菌是受污染的杂菌,要不咋没带。

我卡纳霉素平板中才培养了9个小时就出现了这么多,没理由全是杂菌啊,而且涂步时候酒精等下,涂完就拿胶膜封口了。
3楼2015-02-05 17:09:54
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
DerekSun(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-05 22:01:08
转个别的带其他抗性的质粒到DH5α里,看看是不是你转DNA这步有问题。
植物生理群69993869,为避免广告,申请加入请提供木虫昵称,院校及专业信息
4楼2015-02-05 19:31:18
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Allen206

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
把菌摇起来,大提质粒,转表达载体,表达一下,泡个脚看有没有表达,有表达就对了,没表达就不好说
不想说什么,,,,
5楼2015-02-06 10:49:34
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天地一微尘

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
DerekSun: 金币+2, ★★★很有帮助 2015-02-07 08:54:09
PCR回收样品后,检测过浓度没有?如果回收后浓度太低(低于20)也不行,另外再用几微升做电泳检测一下,片段是否正确的。
BP时间延长至5小时,我们常过夜,做BP时按照说明书中的比例来加PCR产物,pDnor。
还有就是看看DH5α是否正常,你同学用同样的有没有做出来。
6楼2015-02-06 15:08:22
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llearn

铜虫 (初入文坛)

请问楼主最后做出来了吗?我也遇到这个问题了。。。。。
7楼2017-06-23 20:41:07
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伤何处

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

个人经验:大于1KB的片段不管是做TOPO还是BP都很难做了。楼主的问题我们实验室之前也遇到过。采取的方法是加大反应体系的片段和质粒浓度。  目的片段和载体均200ng以上(所以要求回收浓度要足够高,多扩增几管,然后回收到一个柱子里),然后还有1ul BP clonase 总共3微升体系  25℃过夜。第二天转化DH5a
另帖子里提到400kb的CDS? 是400bp吧? 如果是400bp的话,应该很好连,基本满min都是阳性。片段长的话,长得克隆就会很少,但大部分也都是阳性

祝实验顺利
对也罢,错也罢;正也罢,逆也罢;通途也好,崎岖无妨……但问,吾心坚否?若坚,纵使歧路,以铁心,贯穿而过,亦为大道!不坚,便是坦途,也难登临绝顶,观险峰
8楼2017-06-25 14:00:29
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