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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 有没有熟悉gateway cloning的大牛，想不通，求解释啊！
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DerekSun

新虫 (初入文坛)

[求助] 有没有熟悉gateway cloning的大牛，想不通，求解释啊！ 已有5人参与

最近老师叫我用gateway做某基因完整片段的重组和表达，我做了三个月了，BP反应还没搞定，天天挨骂。
详细说一下背景，目的基因大约3Kb，上游有promoter，然后接一个400Kb左右的CDS区，因为做的两步法，所以attB引物加了adapter，引物设计了两对，分别是从promoter前开始到stop codon的（3K左右)，还有仅仅CDS区域的。（当然，为了测序验证，3KB中又分步设计了很多引物）。BP的载体用的gateway入门载体pDnor201，转化的大肠杆菌DH5α。
接上attB引物后，做了电泳验证，在3K和500bp的地方都有条带，所以到此应该没问题。
接下来就问题不断了，首先我BP反应后转入菌，培养后涂平板，发现不长菌。
然后我将BP反应时间从1h延长到shake3h，结果有足够的菌了。
可是随机挑了4处菌，做colony PCR，结果电泳后都没有条带。硬着头皮做了一个sample并拿去测序，什么也没测出来。
那么问题就来了。。。
照理说gateway 控制假阳性效果是非常好的，因为我转进去的话，载体中的ccdm毒蛋白基因一定被置换出来了，则空载体不能生存，而且平板是Kanamycin的，所以杂菌应该不会长。那么培养出来的菌落一定是对的才是啊，可为什么做了四个colony PCR结果都跑不出目的片段呢。
现在非常纠结，老师就是坚信我技术不行，我也不知道我错哪了。奉上四张图，分别是长出的菌落，还有四个colonyPCR电泳的结果，以及备份这四个的mass plate。
请有经验的人帮我分析下原因和下一步怎么做好。有没有熟悉gateway cloning的大牛，想不通，求解释啊！
colony.png


有没有熟悉gateway cloning的大牛，想不通，求解释啊！-1
gel.png


有没有熟悉gateway cloning的大牛，想不通，求解释啊！-2
massplate.png
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1楼 2015-02-05 10:23:59
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zshw_001

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感觉送测前的菌是受污染的杂菌，要不咋没带。
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永远相信未知的总是美好的！
2楼2015-02-05 16:14:49
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DerekSun

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zshw_001 at 2015-02-05 16:14:49
感觉送测前的菌是受污染的杂菌，要不咋没带。

我卡纳霉素平板中才培养了9个小时就出现了这么多，没理由全是杂菌啊，而且涂步时候酒精等下，涂完就拿胶膜封口了。
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3楼2015-02-05 17:09:54
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
DerekSun(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-02-05 22:01:08
转个别的带其他抗性的质粒到DH5α里，看看是不是你转DNA这步有问题。
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
4楼2015-02-05 19:31:18
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Allen206

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
把菌摇起来，大提质粒，转表达载体，表达一下，泡个脚看有没有表达，有表达就对了，没表达就不好说
赞一下 回复此楼
不想说什么，，，，
5楼2015-02-06 10:49:34
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天地一微尘

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
DerekSun: 金币+2, ★★★很有帮助 2015-02-07 08:54:09
PCR回收样品后，检测过浓度没有？如果回收后浓度太低（低于20）也不行，另外再用几微升做电泳检测一下，片段是否正确的。
BP时间延长至5小时，我们常过夜，做BP时按照说明书中的比例来加PCR产物，pDnor。
还有就是看看DH5α是否正常，你同学用同样的有没有做出来。
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6楼2015-02-06 15:08:22
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llearn

铜虫 (初入文坛)
请问楼主最后做出来了吗？我也遇到这个问题了。。。。。
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7楼2017-06-23 20:41:07
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伤何处

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

个人经验：大于1KB的片段不管是做TOPO还是BP都很难做了。楼主的问题我们实验室之前也遇到过。采取的方法是加大反应体系的片段和质粒浓度。  目的片段和载体均200ng以上（所以要求回收浓度要足够高，多扩增几管，然后回收到一个柱子里），然后还有1ul BP clonase 总共3微升体系  25℃过夜。第二天转化DH5a
另帖子里提到400kb的CDS? 是400bp吧？ 如果是400bp的话，应该很好连，基本满min都是阳性。片段长的话，长得克隆就会很少，但大部分也都是阳性

祝实验顺利
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对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
8楼2017-06-25 14:00:29
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