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DerekSun

新虫 (初入文坛)

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虫号: 3673512
注册: 2015-02-01
专业: 植物病理学

[求助] 有没有熟悉gateway cloning的大牛，想不通，求解释啊！已有5人参与

最近老师叫我用gateway做某基因完整片段的重组和表达，我做了三个月了，BP反应还没搞定，天天挨骂。

详细说一下背景，目的基因大约3Kb，上游有promoter，然后接一个400Kb左右的CDS区，因为做的两步法，所以attB引物加了adapter，引物设计了两对，分别是从promoter前开始到stop codon的（3K左右)，还有仅仅CDS区域的。（当然，为了测序验证，3KB中又分步设计了很多引物）。BP的载体用的gateway入门载体pDnor201，转化的大肠杆菌DH5α。
接上attB引物后，做了电泳验证，在3K和500bp的地方都有条带，所以到此应该没问题。
接下来就问题不断了，首先我BP反应后转入菌，培养后涂平板，发现不长菌。
然后我将BP反应时间从1h延长到shake3h，结果有足够的菌了。
可是随机挑了4处菌，做colony PCR，结果电泳后都没有条带。硬着头皮做了一个sample并拿去测序，什么也没测出来。
那么问题就来了。。。
照理说gateway 控制假阳性效果是非常好的，因为我转进去的话，载体中的ccdm毒蛋白基因一定被置换出来了，则空载体不能生存，而且平板是Kanamycin的，所以杂菌应该不会长。那么培养出来的菌落一定是对的才是啊，可为什么做了四个colony PCR结果都跑不出目的片段呢。
现在非常纠结，老师就是坚信我技术不行，我也不知道我错哪了。奉上四张图，分别是长出的菌落，还有四个colonyPCR电泳的结果，以及备份这四个的mass plate。
请有经验的人帮我分析下原因和下一步怎么做好。