| 查看: 862 | 回复: 1 | ||
| 【悬赏金币】回答本帖问题，作者丫头小盆子将赠送您 50 个金币 | ||
[求助]
求助！！使用G418筛选突变体及检测
|
||
|
先向各位大牛前辈致敬！ 以下步入正题————请问有做突变体的前辈没有？我在这里急切的寻求帮助！！我快被这个实验搞疯了，再这样下去我都快抑郁——~~o(>_<  o ~~下面阐述下我最近遇到的问题吧： 首先：我这里实验主要目的是想获得突变体。转化植物筛选的时候，用到的载体只有G418抗性。我的筛选过程是通过进行组培实验完成的，筛选原理是基因重组，对抗性植株进行检验时，引物设计片段尝试过用（1）敲除载体上包括的目的基因片段以及（2）敲除载体上不包含的目的基因片段，但PCR结果都是能检测出目的大小的条带。 其次筛选过程为：G418筛选浓度到50ug/ml，筛选次数为3-4次，每次3-4天，筛选具体点就是转化后的植物先在普通培养基上长到芝麻到油菜籽大小时，用抗性培养基进行筛选培养3-4天，（这里解释下为什么没有直接转化后就在抗性培养基上筛选，是因为我觉得刚转化好的植物细胞没有细胞壁，需要长到一定程度才能筛选，不然会全部筛选死掉。还有就是每次筛选3-4天，筛选时间不是，也是因为我觉得植株太弱了，即使转化进去了，也容易被筛死掉.)。 问题1：经过漫长的筛选后，剩下1/10左右的材料培养长大。然后提RNA，进行半定量PCR，结果内参能PCR出，野生型和突变体都能检测到目的条带。请问下这个情况是属于假阳性么？但是我个人认为假阳性情况的话，植株不是应该死掉或表现出叶片变黄或者表现出生理活性下降的表型吗？还有，这种抗性植株不应该是被我筛选驯化出来的吧？那这种情况是怎么回事呢？ 问题2：因为转化植物时用到的载体标志基因是nptII，我在NCBI上查到了该标志基因的序列，然后用primer 5设计出序列进行PCR检测，结果野生型和抗性植株均出现了nptII 目的大小的条带。 我也Blast了nptII与该植物的序列，发现两者序列很少重合，应该是不可能出现pcr出植物本身序列这种情况的。 对于以上情况我已经没辙了，我也查了有关文献，但是说的都很简单，具体如何设计的检测引物等都不太明白。所以想求助各位有相关经历的前辈能提供点意见和问题，指点一下我这个迷惘的小虫子。谢谢！！！ 还有就是前辈们在这个筛选试验中有遇见过类似这种情况么，遇到过的话又是如何解决的呢，还有就是想问问凭您的经验觉得G418的抗性筛选有效期一般是多少天内有效? 谢谢各位前辈的帮助！再次非常非常万分万分感谢！！！ 小虫致敬！ |
回复此楼» 猜你喜欢
这个博士要读吗
已经有17人回复
-
博后基金刷到的BUG,图片来的更直观
已经有7人回复
-
论文已接收，但发现修改稿传的是旧版该怎么办？
已经有6人回复
-
有人中过人文社科类的博后特助吗？
已经有4人回复
-
F口信息学部拿面上，大概需要什么样的成果
已经有8人回复
-
最新消息：2024国自然下载文件名变了
已经有28人回复
-
去英国的小伙伴儿都在哪儿租的房子呀？
已经有7人回复
-
太卷了
已经有21人回复
-
审稿问题：为什么荧光激发波长和紫外吸收波长差的大？
已经有10人回复
-
初始合伙人来啦！（生物试剂耗材标准品）
已经有21人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 关于二倍体酿酒酵母基因敲除的疑问
已经有15人回复
- CHO细胞中，G418加压筛选与DHFR系统加压筛选的区别？
已经有15人回复
- 关于毕赤酵母G418筛选
已经有9人回复
- 阳性克隆的筛选问题
已经有15人回复
- 悬赏！求一篇含protocol（G418筛选293T稳定株）的文献！我查了一周都没查到，求高手！
已经有3人回复
- G418 和puromycin共筛选
已经有7人回复
- 用pCAMBIA1301为载体转到再转到具有卡娜抗性的植株里去, 可行吗?
已经有4人回复
- 【求助】如何探究两个蛋白质之间的直接或间接相互作用？谢谢！
已经有6人回复
- 外源激素诱导植物根系变长，增多，属于基因突变，还是外形的改变？
已经有7人回复
- 怎么筛选植物抗性基因
已经有10人回复
- 【求助/交流】pcDNA3.1能做G418筛选，获得稳定转染株吗
已经有8人回复
- 【求助/交流】怎样确定一个基因在基因组中是不是单拷贝
已经有5人回复
- 【求助/交流】G418筛选稳定转染
已经有12人回复
- 【分享】G418筛选稳定表达细胞系
已经有17人回复
2楼2014-04-27 09:46:33
10