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丫头小盆子

新虫 (小有名气)

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专业: 植物生理与生化

[求助] 求助！！使用G418筛选突变体及检测

先向各位大牛前辈致敬！
以下步入正题————请问有做突变体的前辈没有？我在这里急切的寻求帮助！！我快被这个实验搞疯了，再这样下去我都快抑郁——~~o(>_<

o ~~
下面阐述下我最近遇到的问题吧：
首先：我这里实验主要目的是想获得突变体。转化植物筛选的时候，用到的载体只有G418抗性。我的筛选过程是通过进行组培实验完成的，筛选原理是基因重组，对抗性植株进行检验时，引物设计片段尝试过用（1）敲除载体上包括的目的基因片段以及（2）敲除载体上不包含的目的基因片段，但PCR结果都是能检测出目的大小的条带。
其次筛选过程为：G418筛选浓度到50ug/ml，筛选次数为3-4次，每次3-4天，筛选具体点就是转化后的植物先在普通培养基上长到芝麻到油菜籽大小时，用抗性培养基进行筛选培养3-4天，（这里解释下为什么没有直接转化后就在抗性培养基上筛选，是因为我觉得刚转化好的植物细胞没有细胞壁，需要长到一定程度才能筛选，不然会全部筛选死掉。还有就是每次筛选3-4天，筛选时间不是，也是因为我觉得植株太弱了，即使转化进去了，也容易被筛死掉.)。
问题1：经过漫长的筛选后，剩下1/10左右的材料培养长大。然后提RNA，进行半定量PCR，结果内参能PCR出，野生型和突变体都能检测到目的条带。请问下这个情况是属于假阳性么？但是我个人认为假阳性情况的话，植株不是应该死掉或表现出叶片变黄或者表现出生理活性下降的表型吗？还有，这种抗性植株不应该是被我筛选驯化出来的吧？那这种情况是怎么回事呢？
问题2：因为转化植物时用到的载体标志基因是nptII，我在NCBI上查到了该标志基因的序列，然后用primer 5设计出序列进行PCR检测，结果野生型和抗性植株均出现了nptII 目的大小的条带。我也Blast了nptII与该植物的序列，发现两者序列很少重合，应该是不可能出现pcr出植物本身序列这种情况的。
对于以上情况我已经没辙了，我也查了有关文献，但是说的都很简单，具体如何设计的检测引物等都不太明白。所以想求助各位有相关经历的前辈能提供点意见和问题，指点一下我这个迷惘的小虫子。谢谢！！！
还有就是前辈们在这个筛选试验中有遇见过类似这种情况么，遇到过的话又是如何解决的呢，还有就是想问问凭您的经验觉得G418的抗性筛选有效期一般是多少天内有效?
谢谢各位前辈的帮助！再次非常非常万分万分感谢！！！
小虫致敬！

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