应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 关于二倍体酿酒酵母基因敲除的疑问
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
161/2返回列表12下一页
查看: 3440  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

一休陈

金虫 (正式写手)

[求助] 关于二倍体酿酒酵母基因敲除的疑问 已有2人参与

各位虫友大家新年好。
    我最近开始做二倍体酿酒酵母基因的敲除工作，现在遇到两个疑问：其一，构建一个（上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂）的敲除盒，一次转化，有没有可能将两个等位基因同时敲除？这样的话，我用菌落PCR验证，P不出来目的基因条带的且带有G418抗性的菌落岂不就是敲除的阳性菌落？ 其二，如果第一点不成立，即是一个敲除盒经过一次转化只能敲除一个等位基因的话，第二个基因我怎么敲除呢？还望有二倍体酿酒酵母敲除经验的虫友们多多指教！再次祝福大家新年快乐，马年龙马精神，百尺竿头，更进一步！谢谢。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

蛋白表达纯化鉴定精华

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-02-12 16:12:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

l68266152

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
一休陈: 金币+5, ★有帮助 2014-02-13 15:20:43
基本不会出现同时双敲的情况。只要有一个拷贝就可以获得抗性的情况下，生物不会浪费多余的精力去弄第二个。

后续试验思路：
1、分单倍体；
2、用另外的抗生素标签敲除另一个基因。
赞一下(2人) 回复此楼
相信自己
2楼2014-02-12 16:31:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
一休陈: 金币+5, ★有帮助 2014-02-13 15:44:12
补充一下楼上，首先要把阳性克隆诱导产孢然后用蜗牛酶和纤维素酶处理掉壁，在导致显微镜下分离単孢，在抗生素的培养基上和PCR验证哪两个孢子或四个孢子全部含有抗性基因，将阳性孢子传代，在HO基因的作用下，变成二倍体酵母，即纯合体酵母。
赞一下 回复此楼
3楼2014-02-13 15:21:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

一休陈

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by l68266152 at 2014-02-12 16:31:17
基本不会出现同时双敲的情况。只要有一个拷贝就可以获得抗性的情况下，生物不会浪费多余的精力去弄第二个。

后续试验思路：
1、分单倍体；
2、用另外的抗生素标签敲除另一个基因。

那请问我首先通过构建一个（上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂）的敲除盒，第一次转化敲除一个等位基因；然后利用Cre酶切掉G418抗性基因；再在这个目的基因内部区域设计并构建敲除盒，第二进行不完全敲除的话，这样的可行性大吗？
赞一下 回复此楼
4楼2014-02-13 15:23:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

一休陈

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yuanbo934 at 2014-02-13 15:21:40
补充一下楼上，首先要把阳性克隆诱导产孢然后用蜗牛酶和纤维素酶处理掉壁，在导致显微镜下分离単孢，在抗生素的培养基上和PCR验证哪两个孢子或四个孢子全部含有抗性基因，将阳性孢子传代，在HO基因的作用下，变成二 ...

那请问我首先通过构建一个（上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂）的敲除盒，第一次转化敲除一个等位基因；然后构建根据目的基因序列，构建一个(“ATG...NNNN同源臂+"UAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA"+"NNNNNN...UAA同源臂"这个一个同源重组组件，通过转化——同源重组，插入一个UAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA若干个的片段起到破坏原有基因的目的，这样，可行性有如何呢？
赞一下 回复此楼
5楼2014-02-13 15:37:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

一休陈

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by l68266152 at 2014-02-12 16:31:17
基本不会出现同时双敲的情况。只要有一个拷贝就可以获得抗性的情况下，生物不会浪费多余的精力去弄第二个。

后续试验思路：
1、分单倍体；
2、用另外的抗生素标签敲除另一个基因。

那请问我首先通过构建一个（上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂）的敲除盒，第一次转化敲除一个等位基因；然后构建根据目的基因序列，构建一个(“ATG...NNNN同源臂+"UAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA"+"NNNNNN...UAA同源臂"这个一个同源重组组件，通过转化——同源重组，插入一个UAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA若干个的片段起到破坏原有基因的目的，这样，可行性有如何呢？
赞一下 回复此楼
6楼2014-02-13 15:37:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

l68266152

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
一休陈: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-02-14 09:03:33
引用回帖:
4楼: Originally posted by 一休陈 at 2014-02-13 15:23:46
那请问我首先通过构建一个（上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂）的敲除盒，第一次转化敲除一个等位基因；然后利用Cre酶切掉G418抗性基因；再在这个目的基因内部区域设计并构建敲除盒，第二进行不完全敲除的话，这 ...

你这两个方案都是可行的，具体的方法还是参照下文献，你用的菌无法分单配体是么？
赞一下 回复此楼
相信自己
7楼2014-02-13 16:33:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dahuaidang

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
一休陈: 金币+5, ★有帮助, URA3突变体的筛选，我们实验室以往做过，没成功。再一个就是老板不让做营养缺陷型菌株。所以，这个方法对我来说基本不考虑了。谢谢。 2014-02-14 09:05:26
建议筛选URA3突变体， 再用URA3去敲， 用FOA筛选去除URA3的菌株，再次敲。
赞一下 回复此楼
发文章发文章，没文章没法混呀。
8楼2014-02-13 21:09:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

一休陈

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by l68266152 at 2014-02-13 16:33:37
你这两个方案都是可行的，具体的方法还是参照下文献，你用的菌无法分单配体是么？...

单倍体的分离，我没有找到合适的文献。看到几篇中文文献，怕做不出来。主要是我对自己的技术有些担心。觉得再去分离单倍体貌似更加麻烦。不知道你分离过单倍体吗？如果做过酿酒酵母单倍体的分离，能否把你做酿酒酵母单倍体的方法发给我一下呢？我的邮箱xi_zhilang@126.com。万分感谢。
赞一下 回复此楼
9楼2014-02-14 09:03:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

l68266152

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 一休陈 at 2014-02-14 09:03:18
单倍体的分离，我没有找到合适的文献。看到几篇中文文献，怕做不出来。主要是我对自己的技术有些担心。觉得再去分离单倍体貌似更加麻烦。不知道你分离过单倍体吗？如果做过酿酒酵母单倍体的分离，能否把你做酿酒酵 ...

实验室其他同学做过，如果是酿酒酵母，这个不用查文献，很多书上就有吧。。。难度应该远小于你做多次敲除。。。
赞一下 回复此楼
相信自己
10楼2014-02-14 10:02:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 一休陈 的主题更新
161/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 生物医药调剂｜SCI中科院三区一作+多项科研成果 +8 likangxing 2026-04-07 11/550 2026-04-08 00:02 by lys0704
[考研] 344求调剂 +11 魏子per 2026-04-07 11/550 2026-04-07 23:01 by JourneyLucky
[考研] 070300化学学硕311分求调剂 +16 梁富贵险中求 2026-04-04 17/850 2026-04-07 22:11 by lijunpoly
[考研] 081700学硕，323分，一志愿中国海洋大学求调剂学校 +19 披星河 2026-04-04 19/950 2026-04-07 15:00 by 上岸快快
[考研] 材料调剂 +17 小刘同学吖吖 2026-04-06 18/900 2026-04-07 11:41 by 诗与自由
[考研] 319分085702安全工程求调剂 +6 rious 2026-04-05 6/300 2026-04-07 09:42 by jp9609
[考研] 材料调剂 +10 一样YWY 2026-04-06 10/500 2026-04-06 21:05 by lbsjt
[考研] 338求调剂 +4 我想上岸ii 2026-04-05 4/200 2026-04-06 21:04 by 木子君1218
[考研] 297分083200求助 +9 aekx 2026-04-05 9/450 2026-04-06 20:57 by flysky1234
[考研] 生物学求调剂 一志愿沪9，326分 +6 刘墨墨 2026-04-06 6/300 2026-04-06 19:36 by lijunpoly
[考研] 0703化学调剂325分 +12 15771691647 2026-04-04 13/650 2026-04-06 12:00 by lijunpoly
[考研] 319求调剂 +3 handrui 2026-04-05 3/150 2026-04-06 09:33 by jp9609
[考研] 085601一志愿北理325分求调剂 +6 找调剂，， 2026-04-02 6/300 2026-04-03 22:20 by 柟�?
[考研] 311求调剂 +11 勇敢的小吴 2026-04-02 11/550 2026-04-03 21:46 by qlm5820
[考研] 考研调剂 +3 Draa 2026-04-03 3/150 2026-04-03 17:37 by hgwz7468
[考研] 材料专硕322分 +13 哈哈哈吼吼吼哈 2026-04-01 13/650 2026-04-03 16:08 by 哦哦123
[考研] 320求调剂 +5 振—TZ 2026-04-02 5/250 2026-04-03 14:42 by fxue1114
[考研] 319求调剂 +18 太容易1018 2026-04-01 18/900 2026-04-03 11:18 by linyelide
[考研] 一志愿武汉理工0856，初试334 +3 26考研材料 2026-04-02 3/150 2026-04-02 21:22 by dongzh2009
[考研] 求调剂 302分初试 0854 +5 伶可乐 2026-04-02 5/250 2026-04-02 17:53 by 笔落锦州
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭