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1楼2013-12-03 15:45:12

jessie06

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肿么木有人捏。。急！

2楼2013-12-04 08:52:59

zilinweizhu

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感谢参与，应助指数 +1
jessie06: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-12-04 10:53:08

你做的是什么交换方式，单交换重组是不能替换基因组上的DNA的，双交换才可以替换，还有就是多倍体要考虑是否完全替换，一般多倍体双交换完全比较困难，需要多次筛选。

3楼2013-12-04 09:56:42

三蛰

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jessie06: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-12-04 10:53:20

还有问题就是可能质粒载体Marker两侧的同源臂与酵母基因组除目的基因外的其他基因有同源性，从而把他取代了？只是假设

我不会！

4楼2013-12-04 10:16:25

jessie06

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引用回帖:

3楼: Originally posted by zilinweizhu at 2013-12-04 09:56:42
你做的是什么交换方式，单交换重组是不能替换基因组上的DNA的，双交换才可以替换，还有就是多倍体要考虑是否完全替换，一般多倍体双交换完全比较困难，需要多次筛选。

是双交换的酵母是单倍体所以比较迷茫。。。

5楼2013-12-04 10:41:30

jessie06

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4楼: Originally posted by 三蛰 at 2013-12-04 10:16:25
还有问题就是可能质粒载体Marker两侧的同源臂与酵母基因组除目的基因外的其他基因有同源性，从而把他取代了？只是假设

考虑了这个所以准备把产物送去测序看看扩出来的序列是不是在设定的位置不知道是否可行？但这个敲除方法包括引物设计都是照着一篇文献上的方法做的方法较为成熟同源臂其实挺短的就是酵母基因组上目的基因前后各约50bp左右，另外各自加上了casette上的约20bp的保守序列构成了扩增转化用的DNA片段的上下游引物。不知我表述是否清楚？

6楼2013-12-04 10:52:21

zilinweizhu

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有没有什么抗性筛选？交换后的质粒在传代后需要丢弃才行，要是仍然存在酵母中就能扩增处条带。具体过程不是很清楚，因此只是猜测，希望对你科研有帮助！

7楼2013-12-04 12:16:10

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7楼: Originally posted by zilinweizhu at 2013-12-04 12:16:10
有没有什么抗性筛选？交换后的质粒在传代后需要丢弃才行，要是仍然存在酵母中就能扩增处条带。具体过程不是很清楚，因此只是猜测，希望对你科研有帮助！

嗯我是直接转的DNA片段，DNA片段两端分别为目的基因上下游的同源臂，中间替换目的基因的包含抗性基因 NAT，转化后涂的是NAT平板，也是在加了NAT的YPA里摇的。。。

8楼2013-12-04 14:00:14

三蛰

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6楼: Originally posted by jessie06 at 2013-12-04 10:52:21
考虑了这个所以准备把产物送去测序看看扩出来的序列是不是在设定的位置不知道是否可行？但这个敲除方法包括引物设计都是照着一篇文献上的方法做的方法较为成熟同源臂其实挺短的就是酵母基因组上目的基因前后 ...

那百分之九十不是这个问题了，我下一步也要做这个，lz加油！分子生物这东西玩的就是不断遇到困难，不断解决困难呀，等待你成功的消息！

我不会！

9楼2013-12-04 16:31:34

jessie06

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9楼: Originally posted by 三蛰 at 2013-12-04 16:31:34
那百分之九十不是这个问题了，我下一步也要做这个，lz加油！分子生物这东西玩的就是不断遇到困难，不断解决困难呀，等待你成功的消息！...

我要敲的目的基因位于酵母一染色体端粒区，共不到200bp,经过比对分析，在同一染色体上其下游就有120bp的片段跟它完全一致，所以这个敲除打击了我，让我迷茫不知所措了。。都想放弃了~ 谢谢你，祝成功哈 ~

10楼2013-12-04 20:20:58