24小时热门版块排行榜    

北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
查看: 2416  |  回复: 13

jessie06

木虫 (正式写手)

[求助] 酿酒酵母基因敲除遇到了问题,求高手指点! 已有1人参与

如题,最近在做酿酒酵母的基因敲除,目的基因是一段~150bp的nc RNA,利用同源重组原理从pMY17上PCR获得一段两端同源的DNA片段对酵母进行了醋酸锂转化,鉴定时,质粒上的片段是重组上去了,但同时要敲除的目的基因A依然存在,如图所示,是什么情况?如何解决?新手求指导!!金币不多,略表谢意!
酿酒酵母基因敲除遇到了问题,求高手指点!
未命名.JPG
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jessie06

木虫 (正式写手)

肿么木有人捏。。急!
2楼2013-12-04 08:52:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zilinweizhu

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
jessie06: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-12-04 10:53:08
你做的是什么交换方式,单交换重组是不能替换基因组上的DNA的,双交换才可以替换,还有就是多倍体要考虑是否完全替换,一般多倍体双交换完全比较困难,需要多次筛选。
3楼2013-12-04 09:56:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三蛰

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
jessie06: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-12-04 10:53:20
还有问题就是可能质粒载体Marker两侧的同源臂与酵母基因组除目的基因外的其他基因有同源性,从而把他取代了?只是假设
我不会!
4楼2013-12-04 10:16:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jessie06

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by zilinweizhu at 2013-12-04 09:56:42
你做的是什么交换方式,单交换重组是不能替换基因组上的DNA的,双交换才可以替换,还有就是多倍体要考虑是否完全替换,一般多倍体双交换完全比较困难,需要多次筛选。

是双交换的 酵母是单倍体 所以比较迷茫。。。
5楼2013-12-04 10:41:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jessie06

木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 三蛰 at 2013-12-04 10:16:25
还有问题就是可能质粒载体Marker两侧的同源臂与酵母基因组除目的基因外的其他基因有同源性,从而把他取代了?只是假设

考虑了这个 所以准备把产物送去测序看看扩出来的序列是不是在设定的位置 不知道是否可行? 但这个敲除方法包括引物设计都是照着一篇文献上的方法做的 方法较为成熟 同源臂其实挺短的 就是酵母基因组上目的基因前后各约50bp左右,另外各自加上了casette上的约20bp的保守序列构成了扩增转化用的DNA片段的上下游引物。不知我表述是否清楚?
6楼2013-12-04 10:52:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zilinweizhu

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

有没有什么抗性筛选?交换后的质粒在传代后需要丢弃才行,要是仍然存在酵母中就能扩增处条带。具体过程不是很清楚,因此只是猜测,希望对你科研有帮助!
7楼2013-12-04 12:16:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jessie06

木虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by zilinweizhu at 2013-12-04 12:16:10
有没有什么抗性筛选?交换后的质粒在传代后需要丢弃才行,要是仍然存在酵母中就能扩增处条带。具体过程不是很清楚,因此只是猜测,希望对你科研有帮助!

嗯 我是直接转的DNA片段,DNA片段两端分别为目的基因上下游的同源臂,中间替换目的基因的包含抗性基因 NAT,转化后涂的是NAT平板,也是在加了NAT的YPA里摇的。。。
8楼2013-12-04 14:00:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三蛰

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by jessie06 at 2013-12-04 10:52:21
考虑了这个 所以准备把产物送去测序看看扩出来的序列是不是在设定的位置 不知道是否可行? 但这个敲除方法包括引物设计都是照着一篇文献上的方法做的 方法较为成熟 同源臂其实挺短的 就是酵母基因组上目的基因前后 ...

那百分之九十不是这个问题了,我下一步也要做这个,lz加油!分子生物这东西玩的就是不断遇到困难,不断解决困难呀,等待你成功的消息!
我不会!
9楼2013-12-04 16:31:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jessie06

木虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 三蛰 at 2013-12-04 16:31:34
那百分之九十不是这个问题了,我下一步也要做这个,lz加油!分子生物这东西玩的就是不断遇到困难,不断解决困难呀,等待你成功的消息!...

我要敲的目的基因位于酵母一染色体端粒区,共不到200bp,经过比对分析,在同一染色体上其下游就有120bp的片段跟它完全一致,所以这个敲除打击了我,让我迷茫不知所措了。。都想放弃了~ 谢谢你,祝成功哈 ~
10楼2013-12-04 20:20:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 jessie06 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 生物学硕341求调剂 +3 你笑起来像云朵 2026-04-03 3/150 2026-04-03 08:15 by fangshan711
[考研] 070305高分子化学与物理 304分求调剂 +16 c297914 2026-03-28 16/800 2026-04-02 20:50 by dongzh2009
[考研] 285求调剂 +8 AZMK 2026-04-02 11/550 2026-04-02 20:16 by yulian1987
[考研] 316求调剂 +12 舟自梗 2026-04-01 16/800 2026-04-02 17:33 by zzsw+
[考研] 能源动力 调剂 +3 不破不立0 2026-04-02 3/150 2026-04-02 12:46 by ffffjjjj
[考研] 085601一志愿中山大学深圳材料工程330求调剂 +8 pipiver 2026-03-30 8/400 2026-04-02 12:01 by ms629
[考研] 292分,材料与化工,申请调剂 +19 程晴之 2026-04-01 23/1150 2026-04-02 11:59 by 程晴之
[考研] 一志愿北交大材料工程总分358 +3 cs0106 2026-04-02 5/250 2026-04-02 11:37 by olim
[考研] 英一数一408,总分284,二战真诚求调剂 +12 12.27 2026-03-30 14/700 2026-04-02 00:18 by 欣喜777
[考研] 291求调剂 +20 Y-cap 2026-03-29 25/1250 2026-04-01 23:49 by 欣喜777
[考研] 070300一志愿211,312分求调剂院校 +14 小黄鸭宝 2026-03-30 14/700 2026-04-01 20:19 by 赖春艳
[考研] 290求调剂 +5 dfffsar 2026-03-29 5/250 2026-04-01 19:45 by 6781022
[硕博家园] 博一被送出联培感觉不适应怎么办 +3 全村的狗 2026-03-31 3/150 2026-04-01 10:44 by 328838485
[考研] 求调剂,一志愿北林食品与营养095500,301分,已过六级,有科研经历 +4 快乐储蓄罐 2026-03-31 4/200 2026-04-01 09:26 by JourneyLucky
[考研] 0856调剂 +7 曲听筠 2026-03-30 7/350 2026-04-01 08:51 by JourneyLucky
[考研] 289求调剂 +7 BrightLL 2026-03-29 7/350 2026-03-31 22:05 by 544594351
[考研] 293分求调剂,外语为俄语 +5 加一一九 2026-03-31 5/250 2026-03-31 09:39 by zhshch
[考研] 105500药学求调剂,一志愿山东大学药学,348分 +3 gr哈哈哈 2026-03-28 3/150 2026-03-30 18:56 by 源_2020
[考研] 085602 化工专硕 338分 求调剂 +12 路痴小琪 2026-03-27 12/600 2026-03-28 15:41 by L135790
[考研] 药学105500求调剂 +3 Ssun。。 2026-03-28 3/150 2026-03-28 11:24 by lxf170613
信息提示
请填处理意见