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jessie06

木虫 (正式写手)

[求助] 酿酒酵母基因敲除遇到了问题,求高手指点! 已有1人参与

如题,最近在做酿酒酵母的基因敲除,目的基因是一段~150bp的nc RNA,利用同源重组原理从pMY17上PCR获得一段两端同源的DNA片段对酵母进行了醋酸锂转化,鉴定时,质粒上的片段是重组上去了,但同时要敲除的目的基因A依然存在,如图所示,是什么情况?如何解决?新手求指导!!金币不多,略表谢意!
酿酒酵母基因敲除遇到了问题,求高手指点!
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jessie06

木虫 (正式写手)

肿么木有人捏。。急!
2楼2013-12-04 08:52:59
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zilinweizhu

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
jessie06: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-12-04 10:53:08
你做的是什么交换方式,单交换重组是不能替换基因组上的DNA的,双交换才可以替换,还有就是多倍体要考虑是否完全替换,一般多倍体双交换完全比较困难,需要多次筛选。
3楼2013-12-04 09:56:42
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三蛰

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
jessie06: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-12-04 10:53:20
还有问题就是可能质粒载体Marker两侧的同源臂与酵母基因组除目的基因外的其他基因有同源性,从而把他取代了?只是假设
我不会!
4楼2013-12-04 10:16:25
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jessie06

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by zilinweizhu at 2013-12-04 09:56:42
你做的是什么交换方式,单交换重组是不能替换基因组上的DNA的,双交换才可以替换,还有就是多倍体要考虑是否完全替换,一般多倍体双交换完全比较困难,需要多次筛选。

是双交换的 酵母是单倍体 所以比较迷茫。。。
5楼2013-12-04 10:41:30
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jessie06

木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 三蛰 at 2013-12-04 10:16:25
还有问题就是可能质粒载体Marker两侧的同源臂与酵母基因组除目的基因外的其他基因有同源性,从而把他取代了?只是假设

考虑了这个 所以准备把产物送去测序看看扩出来的序列是不是在设定的位置 不知道是否可行? 但这个敲除方法包括引物设计都是照着一篇文献上的方法做的 方法较为成熟 同源臂其实挺短的 就是酵母基因组上目的基因前后各约50bp左右,另外各自加上了casette上的约20bp的保守序列构成了扩增转化用的DNA片段的上下游引物。不知我表述是否清楚?
6楼2013-12-04 10:52:21
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zilinweizhu

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

有没有什么抗性筛选?交换后的质粒在传代后需要丢弃才行,要是仍然存在酵母中就能扩增处条带。具体过程不是很清楚,因此只是猜测,希望对你科研有帮助!
7楼2013-12-04 12:16:10
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jessie06

木虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by zilinweizhu at 2013-12-04 12:16:10
有没有什么抗性筛选?交换后的质粒在传代后需要丢弃才行,要是仍然存在酵母中就能扩增处条带。具体过程不是很清楚,因此只是猜测,希望对你科研有帮助!

嗯 我是直接转的DNA片段,DNA片段两端分别为目的基因上下游的同源臂,中间替换目的基因的包含抗性基因 NAT,转化后涂的是NAT平板,也是在加了NAT的YPA里摇的。。。
8楼2013-12-04 14:00:14
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三蛰

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by jessie06 at 2013-12-04 10:52:21
考虑了这个 所以准备把产物送去测序看看扩出来的序列是不是在设定的位置 不知道是否可行? 但这个敲除方法包括引物设计都是照着一篇文献上的方法做的 方法较为成熟 同源臂其实挺短的 就是酵母基因组上目的基因前后 ...

那百分之九十不是这个问题了,我下一步也要做这个,lz加油!分子生物这东西玩的就是不断遇到困难,不断解决困难呀,等待你成功的消息!
我不会!
9楼2013-12-04 16:31:34
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jessie06

木虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 三蛰 at 2013-12-04 16:31:34
那百分之九十不是这个问题了,我下一步也要做这个,lz加油!分子生物这东西玩的就是不断遇到困难,不断解决困难呀,等待你成功的消息!...

我要敲的目的基因位于酵母一染色体端粒区,共不到200bp,经过比对分析,在同一染色体上其下游就有120bp的片段跟它完全一致,所以这个敲除打击了我,让我迷茫不知所措了。。都想放弃了~ 谢谢你,祝成功哈 ~
10楼2013-12-04 20:20:58
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