24小时热门版块排行榜    

查看: 2780  |  回复: 13

jessie06

木虫 (正式写手)

[求助] 酿酒酵母基因敲除遇到了问题,求高手指点! 已有1人参与

如题,最近在做酿酒酵母的基因敲除,目的基因是一段~150bp的nc RNA,利用同源重组原理从pMY17上PCR获得一段两端同源的DNA片段对酵母进行了醋酸锂转化,鉴定时,质粒上的片段是重组上去了,但同时要敲除的目的基因A依然存在,如图所示,是什么情况?如何解决?新手求指导!!金币不多,略表谢意!
酿酒酵母基因敲除遇到了问题,求高手指点!
未命名.JPG
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jessie06

木虫 (正式写手)

肿么木有人捏。。急!
2楼2013-12-04 08:52:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zilinweizhu

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
jessie06: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-12-04 10:53:08
你做的是什么交换方式,单交换重组是不能替换基因组上的DNA的,双交换才可以替换,还有就是多倍体要考虑是否完全替换,一般多倍体双交换完全比较困难,需要多次筛选。
3楼2013-12-04 09:56:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三蛰

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
jessie06: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-12-04 10:53:20
还有问题就是可能质粒载体Marker两侧的同源臂与酵母基因组除目的基因外的其他基因有同源性,从而把他取代了?只是假设
我不会!
4楼2013-12-04 10:16:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jessie06

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by zilinweizhu at 2013-12-04 09:56:42
你做的是什么交换方式,单交换重组是不能替换基因组上的DNA的,双交换才可以替换,还有就是多倍体要考虑是否完全替换,一般多倍体双交换完全比较困难,需要多次筛选。

是双交换的 酵母是单倍体 所以比较迷茫。。。
5楼2013-12-04 10:41:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jessie06

木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 三蛰 at 2013-12-04 10:16:25
还有问题就是可能质粒载体Marker两侧的同源臂与酵母基因组除目的基因外的其他基因有同源性,从而把他取代了?只是假设

考虑了这个 所以准备把产物送去测序看看扩出来的序列是不是在设定的位置 不知道是否可行? 但这个敲除方法包括引物设计都是照着一篇文献上的方法做的 方法较为成熟 同源臂其实挺短的 就是酵母基因组上目的基因前后各约50bp左右,另外各自加上了casette上的约20bp的保守序列构成了扩增转化用的DNA片段的上下游引物。不知我表述是否清楚?
6楼2013-12-04 10:52:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zilinweizhu

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

有没有什么抗性筛选?交换后的质粒在传代后需要丢弃才行,要是仍然存在酵母中就能扩增处条带。具体过程不是很清楚,因此只是猜测,希望对你科研有帮助!
7楼2013-12-04 12:16:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jessie06

木虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by zilinweizhu at 2013-12-04 12:16:10
有没有什么抗性筛选?交换后的质粒在传代后需要丢弃才行,要是仍然存在酵母中就能扩增处条带。具体过程不是很清楚,因此只是猜测,希望对你科研有帮助!

嗯 我是直接转的DNA片段,DNA片段两端分别为目的基因上下游的同源臂,中间替换目的基因的包含抗性基因 NAT,转化后涂的是NAT平板,也是在加了NAT的YPA里摇的。。。
8楼2013-12-04 14:00:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三蛰

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by jessie06 at 2013-12-04 10:52:21
考虑了这个 所以准备把产物送去测序看看扩出来的序列是不是在设定的位置 不知道是否可行? 但这个敲除方法包括引物设计都是照着一篇文献上的方法做的 方法较为成熟 同源臂其实挺短的 就是酵母基因组上目的基因前后 ...

那百分之九十不是这个问题了,我下一步也要做这个,lz加油!分子生物这东西玩的就是不断遇到困难,不断解决困难呀,等待你成功的消息!
我不会!
9楼2013-12-04 16:31:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jessie06

木虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 三蛰 at 2013-12-04 16:31:34
那百分之九十不是这个问题了,我下一步也要做这个,lz加油!分子生物这东西玩的就是不断遇到困难,不断解决困难呀,等待你成功的消息!...

我要敲的目的基因位于酵母一染色体端粒区,共不到200bp,经过比对分析,在同一染色体上其下游就有120bp的片段跟它完全一致,所以这个敲除打击了我,让我迷茫不知所措了。。都想放弃了~ 谢谢你,祝成功哈 ~
10楼2013-12-04 20:20:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 jessie06 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +4 炎黄贵胄 2026-08-22 5/250 2026-08-24 02:09 by 流流伤
[基金申请] 让我中一个面上吧! +12 大萍1987 2026-08-20 15/750 2026-08-23 20:44 by 大萍1987
[基金申请] 什么时候开奖? +9 CrisMessi 2026-08-18 10/500 2026-08-23 12:03 by 丶昵称占用
[基金申请] 今天放榜吗? +15 布布和一二 2026-08-19 16/800 2026-08-23 09:55 by 张春生
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +7 且听虎啸 2026-08-17 8/400 2026-08-22 21:55 by 医学老男孩
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +24 yaoyewhu2008 2026-08-20 26/1300 2026-08-22 17:43 by kammury
[基金申请] filecode,4个jtjc了 +13 ziyangfang 2026-08-19 16/800 2026-08-22 17:08 by WH3796
[基金申请] 人气不行了 +8 fansofjerry 2026-08-21 8/400 2026-08-22 16:30 by zyqchem
[基金申请] 今天基金会出结果吗?20260819 +16 kkkl_v 2026-08-19 17/850 2026-08-22 16:12 by 阿布Abu
[基金申请] 时间戳今天,20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 放榜前的不淡定 40+4 snowwithsea 2026-08-19 14/700 2026-08-21 23:51 by cratir
[基金申请] 今日不放榜?网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +16 医学老男孩 2026-08-20 20/1000 2026-08-21 21:13 by Ldrop2023
[基金申请] 科研孤儿太难了 +17 我4大白菜 2026-08-20 18/900 2026-08-21 20:57 by zhangev
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +7 angus9576 2026-08-17 12/600 2026-08-21 13:38 by weiyin
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧? +4 哈哈蛤? 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[论文投稿] 投稿咨询 +5 wwm09 2026-08-17 7/350 2026-08-21 10:11 by 期刊论文帮手
[基金申请] 估计是周四 +3 archvillain 2026-08-18 3/150 2026-08-21 01:48 by jnhyjjm
[基金申请] 时间戳变了,能看出什么问题? +18 基诺咪客 2026-08-17 23/1150 2026-08-20 17:19 by Godzela
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
信息提示
请填处理意见