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jessie06

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[求助] 酿酒酵母基因敲除遇到了问题，求高手指点！已有1人参与

如题，最近在做酿酒酵母的基因敲除，目的基因是一段~150bp的nc RNA，利用同源重组原理从pMY17上PCR获得一段两端同源的DNA片段对酵母进行了醋酸锂转化，鉴定时，质粒上的片段是重组上去了，但同时要敲除的目的基因A依然存在，如图所示，是什么情况？如何解决？新手求指导！！金币不多，略表谢意！

未命名.JPG

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1楼 2013-12-03 15:45:12

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jessie06

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引用回帖:

4楼: Originally posted by 三蛰 at 2013-12-04 10:16:25
还有问题就是可能质粒载体Marker两侧的同源臂与酵母基因组除目的基因外的其他基因有同源性，从而把他取代了？只是假设

考虑了这个所以准备把产物送去测序看看扩出来的序列是不是在设定的位置不知道是否可行？但这个敲除方法包括引物设计都是照着一篇文献上的方法做的方法较为成熟同源臂其实挺短的就是酵母基因组上目的基因前后各约50bp左右，另外各自加上了casette上的约20bp的保守序列构成了扩增转化用的DNA片段的上下游引物。不知我表述是否清楚？