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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 关于二倍体酿酒酵母基因敲除的疑问
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一休陈

金虫 (正式写手)

[求助] 关于二倍体酿酒酵母基因敲除的疑问 已有2人参与

各位虫友大家新年好。
    我最近开始做二倍体酿酒酵母基因的敲除工作，现在遇到两个疑问：其一，构建一个（上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂）的敲除盒，一次转化，有没有可能将两个等位基因同时敲除？这样的话，我用菌落PCR验证，P不出来目的基因条带的且带有G418抗性的菌落岂不就是敲除的阳性菌落？ 其二，如果第一点不成立，即是一个敲除盒经过一次转化只能敲除一个等位基因的话，第二个基因我怎么敲除呢？还望有二倍体酿酒酵母敲除经验的虫友们多多指教！再次祝福大家新年快乐，马年龙马精神，百尺竿头，更进一步！谢谢。
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1楼 2014-02-12 16:12:36
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l68266152

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
一休陈: 金币+5, ★有帮助 2014-02-13 15:20:43
基本不会出现同时双敲的情况。只要有一个拷贝就可以获得抗性的情况下，生物不会浪费多余的精力去弄第二个。

后续试验思路：
1、分单倍体；
2、用另外的抗生素标签敲除另一个基因。
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2楼2014-02-12 16:31:17
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yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
一休陈: 金币+5, ★有帮助 2014-02-13 15:44:12
补充一下楼上，首先要把阳性克隆诱导产孢然后用蜗牛酶和纤维素酶处理掉壁，在导致显微镜下分离単孢，在抗生素的培养基上和PCR验证哪两个孢子或四个孢子全部含有抗性基因，将阳性孢子传代，在HO基因的作用下，变成二倍体酵母，即纯合体酵母。
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3楼2014-02-13 15:21:40
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一休陈

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by l68266152 at 2014-02-12 16:31:17
基本不会出现同时双敲的情况。只要有一个拷贝就可以获得抗性的情况下，生物不会浪费多余的精力去弄第二个。

后续试验思路：
1、分单倍体；
2、用另外的抗生素标签敲除另一个基因。

那请问我首先通过构建一个（上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂）的敲除盒，第一次转化敲除一个等位基因；然后利用Cre酶切掉G418抗性基因；再在这个目的基因内部区域设计并构建敲除盒，第二进行不完全敲除的话，这样的可行性大吗？
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4楼2014-02-13 15:23:46
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一休陈

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yuanbo934 at 2014-02-13 15:21:40
补充一下楼上，首先要把阳性克隆诱导产孢然后用蜗牛酶和纤维素酶处理掉壁，在导致显微镜下分离単孢，在抗生素的培养基上和PCR验证哪两个孢子或四个孢子全部含有抗性基因，将阳性孢子传代，在HO基因的作用下，变成二 ...

那请问我首先通过构建一个（上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂）的敲除盒，第一次转化敲除一个等位基因；然后构建根据目的基因序列，构建一个(“ATG...NNNN同源臂+"UAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA"+"NNNNNN...UAA同源臂"这个一个同源重组组件，通过转化——同源重组，插入一个UAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA若干个的片段起到破坏原有基因的目的，这样，可行性有如何呢？
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5楼2014-02-13 15:37:32
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一休陈

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by l68266152 at 2014-02-12 16:31:17
基本不会出现同时双敲的情况。只要有一个拷贝就可以获得抗性的情况下，生物不会浪费多余的精力去弄第二个。

后续试验思路：
1、分单倍体；
2、用另外的抗生素标签敲除另一个基因。

那请问我首先通过构建一个（上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂）的敲除盒，第一次转化敲除一个等位基因；然后构建根据目的基因序列，构建一个(“ATG...NNNN同源臂+"UAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA"+"NNNNNN...UAA同源臂"这个一个同源重组组件，通过转化——同源重组，插入一个UAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA若干个的片段起到破坏原有基因的目的，这样，可行性有如何呢？
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6楼2014-02-13 15:37:39
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l68266152

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
一休陈: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-02-14 09:03:33
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4楼: Originally posted by 一休陈 at 2014-02-13 15:23:46
那请问我首先通过构建一个（上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂）的敲除盒，第一次转化敲除一个等位基因；然后利用Cre酶切掉G418抗性基因；再在这个目的基因内部区域设计并构建敲除盒，第二进行不完全敲除的话，这 ...

你这两个方案都是可行的，具体的方法还是参照下文献，你用的菌无法分单配体是么？
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7楼2014-02-13 16:33:37
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dahuaidang

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
一休陈: 金币+5, ★有帮助, URA3突变体的筛选，我们实验室以往做过，没成功。再一个就是老板不让做营养缺陷型菌株。所以，这个方法对我来说基本不考虑了。谢谢。 2014-02-14 09:05:26
建议筛选URA3突变体， 再用URA3去敲， 用FOA筛选去除URA3的菌株，再次敲。
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发文章发文章，没文章没法混呀。
8楼2014-02-13 21:09:16
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一休陈

金虫 (正式写手)
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7楼: Originally posted by l68266152 at 2014-02-13 16:33:37
你这两个方案都是可行的，具体的方法还是参照下文献，你用的菌无法分单配体是么？...

单倍体的分离，我没有找到合适的文献。看到几篇中文文献，怕做不出来。主要是我对自己的技术有些担心。觉得再去分离单倍体貌似更加麻烦。不知道你分离过单倍体吗？如果做过酿酒酵母单倍体的分离，能否把你做酿酒酵母单倍体的方法发给我一下呢？我的邮箱xi_zhilang@126.com。万分感谢。
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9楼2014-02-14 09:03:18
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l68266152

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 一休陈 at 2014-02-14 09:03:18
单倍体的分离，我没有找到合适的文献。看到几篇中文文献，怕做不出来。主要是我对自己的技术有些担心。觉得再去分离单倍体貌似更加麻烦。不知道你分离过单倍体吗？如果做过酿酒酵母单倍体的分离，能否把你做酿酒酵 ...

实验室其他同学做过，如果是酿酒酵母，这个不用查文献，很多书上就有吧。。。难度应该远小于你做多次敲除。。。
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10楼2014-02-14 10:02:27
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