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一休陈

金虫 (正式写手)

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[求助] 关于二倍体酿酒酵母基因敲除的疑问已有2人参与

各位虫友大家新年好。
我最近开始做二倍体酿酒酵母基因的敲除工作，现在遇到两个疑问：其一，构建一个（上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂）的敲除盒，一次转化，有没有可能将两个等位基因同时敲除？这样的话，我用菌落PCR验证，P不出来目的基因条带的且带有G418抗性的菌落岂不就是敲除的阳性菌落？其二，如果第一点不成立，即是一个敲除盒经过一次转化只能敲除一个等位基因的话，第二个基因我怎么敲除呢？还望有二倍体酿酒酵母敲除经验的虫友们多多指教！再次祝福大家新年快乐，马年龙马精神，百尺竿头，更进一步！谢谢。

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1楼 2014-02-12 16:12:36

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一休陈

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引用回帖:

2楼: Originally posted by l68266152 at 2014-02-12 16:31:17
基本不会出现同时双敲的情况。只要有一个拷贝就可以获得抗性的情况下，生物不会浪费多余的精力去弄第二个。

后续试验思路：
1、分单倍体；
2、用另外的抗生素标签敲除另一个基因。

那请问我首先通过构建一个（上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂）的敲除盒，第一次转化敲除一个等位基因；然后构建根据目的基因序列，构建一个(“ATG...NNNN同源臂+"UAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA"+"NNNNNN...UAA同源臂"这个一个同源重组组件，通过转化——同源重组，插入一个UAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA若干个的片段起到破坏原有基因的目的，这样，可行性有如何呢？