应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 关于二倍体酿酒酵母基因敲除的疑问
161/2返回列表12下一页
查看: 3383  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

一休陈

金虫 (正式写手)

[求助] 关于二倍体酿酒酵母基因敲除的疑问 已有2人参与

各位虫友大家新年好。
    我最近开始做二倍体酿酒酵母基因的敲除工作，现在遇到两个疑问：其一，构建一个（上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂）的敲除盒，一次转化，有没有可能将两个等位基因同时敲除？这样的话，我用菌落PCR验证，P不出来目的基因条带的且带有G418抗性的菌落岂不就是敲除的阳性菌落？ 其二，如果第一点不成立，即是一个敲除盒经过一次转化只能敲除一个等位基因的话，第二个基因我怎么敲除呢？还望有二倍体酿酒酵母敲除经验的虫友们多多指教！再次祝福大家新年快乐，马年龙马精神，百尺竿头，更进一步！谢谢。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

蛋白表达纯化鉴定精华

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-02-12 16:12:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

l68266152

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
一休陈: 金币+5, ★有帮助 2014-02-13 15:20:43
基本不会出现同时双敲的情况。只要有一个拷贝就可以获得抗性的情况下，生物不会浪费多余的精力去弄第二个。

后续试验思路：
1、分单倍体；
2、用另外的抗生素标签敲除另一个基因。
赞一下(2人) 回复此楼
相信自己
2楼2014-02-12 16:31:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
一休陈: 金币+5, ★有帮助 2014-02-13 15:44:12
补充一下楼上，首先要把阳性克隆诱导产孢然后用蜗牛酶和纤维素酶处理掉壁，在导致显微镜下分离単孢，在抗生素的培养基上和PCR验证哪两个孢子或四个孢子全部含有抗性基因，将阳性孢子传代，在HO基因的作用下，变成二倍体酵母，即纯合体酵母。
赞一下 回复此楼
3楼2014-02-13 15:21:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

一休陈

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by l68266152 at 2014-02-12 16:31:17
基本不会出现同时双敲的情况。只要有一个拷贝就可以获得抗性的情况下，生物不会浪费多余的精力去弄第二个。

后续试验思路：
1、分单倍体；
2、用另外的抗生素标签敲除另一个基因。

那请问我首先通过构建一个（上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂）的敲除盒，第一次转化敲除一个等位基因；然后利用Cre酶切掉G418抗性基因；再在这个目的基因内部区域设计并构建敲除盒，第二进行不完全敲除的话，这样的可行性大吗？
赞一下 回复此楼
4楼2014-02-13 15:23:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

一休陈

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yuanbo934 at 2014-02-13 15:21:40
补充一下楼上，首先要把阳性克隆诱导产孢然后用蜗牛酶和纤维素酶处理掉壁，在导致显微镜下分离単孢，在抗生素的培养基上和PCR验证哪两个孢子或四个孢子全部含有抗性基因，将阳性孢子传代，在HO基因的作用下，变成二 ...

那请问我首先通过构建一个（上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂）的敲除盒，第一次转化敲除一个等位基因；然后构建根据目的基因序列，构建一个(“ATG...NNNN同源臂+"UAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA"+"NNNNNN...UAA同源臂"这个一个同源重组组件，通过转化——同源重组，插入一个UAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA若干个的片段起到破坏原有基因的目的，这样，可行性有如何呢？
赞一下 回复此楼
5楼2014-02-13 15:37:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

一休陈

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by l68266152 at 2014-02-12 16:31:17
基本不会出现同时双敲的情况。只要有一个拷贝就可以获得抗性的情况下，生物不会浪费多余的精力去弄第二个。

后续试验思路：
1、分单倍体；
2、用另外的抗生素标签敲除另一个基因。

那请问我首先通过构建一个（上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂）的敲除盒，第一次转化敲除一个等位基因；然后构建根据目的基因序列，构建一个(“ATG...NNNN同源臂+"UAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA"+"NNNNNN...UAA同源臂"这个一个同源重组组件，通过转化——同源重组，插入一个UAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA若干个的片段起到破坏原有基因的目的，这样，可行性有如何呢？
赞一下 回复此楼
6楼2014-02-13 15:37:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

l68266152

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
一休陈: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-02-14 09:03:33
引用回帖:
4楼: Originally posted by 一休陈 at 2014-02-13 15:23:46
那请问我首先通过构建一个（上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂）的敲除盒，第一次转化敲除一个等位基因；然后利用Cre酶切掉G418抗性基因；再在这个目的基因内部区域设计并构建敲除盒，第二进行不完全敲除的话，这 ...

你这两个方案都是可行的，具体的方法还是参照下文献，你用的菌无法分单配体是么？
赞一下 回复此楼
相信自己
7楼2014-02-13 16:33:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dahuaidang

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
一休陈: 金币+5, ★有帮助, URA3突变体的筛选，我们实验室以往做过，没成功。再一个就是老板不让做营养缺陷型菌株。所以，这个方法对我来说基本不考虑了。谢谢。 2014-02-14 09:05:26
建议筛选URA3突变体， 再用URA3去敲， 用FOA筛选去除URA3的菌株，再次敲。
赞一下 回复此楼
发文章发文章，没文章没法混呀。
8楼2014-02-13 21:09:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

一休陈

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by l68266152 at 2014-02-13 16:33:37
你这两个方案都是可行的，具体的方法还是参照下文献，你用的菌无法分单配体是么？...

单倍体的分离，我没有找到合适的文献。看到几篇中文文献，怕做不出来。主要是我对自己的技术有些担心。觉得再去分离单倍体貌似更加麻烦。不知道你分离过单倍体吗？如果做过酿酒酵母单倍体的分离，能否把你做酿酒酵母单倍体的方法发给我一下呢？我的邮箱xi_zhilang@126.com。万分感谢。
赞一下 回复此楼
9楼2014-02-14 09:03:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

l68266152

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 一休陈 at 2014-02-14 09:03:18
单倍体的分离，我没有找到合适的文献。看到几篇中文文献，怕做不出来。主要是我对自己的技术有些担心。觉得再去分离单倍体貌似更加麻烦。不知道你分离过单倍体吗？如果做过酿酒酵母单倍体的分离，能否把你做酿酒酵 ...

实验室其他同学做过，如果是酿酒酵母，这个不用查文献，很多书上就有吧。。。难度应该远小于你做多次敲除。。。
赞一下 回复此楼
相信自己
10楼2014-02-14 10:02:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 一休陈 的主题更新
161/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料与化工一志愿南昌大学327求调剂推荐 +8 Ncdx123456 2026-03-13 9/450 2026-03-18 14:40 by haxia
[考研] 材料专硕306英一数二 +10 z1z2z3879 2026-03-16 13/650 2026-03-18 14:20 by 007_lilei
[考研] 302求调剂 +10 呼呼呼。。。。 2026-03-17 10/500 2026-03-18 12:45 by Linda Hu
[考研] 0703化学调剂 +4 pupcoco 2026-03-17 7/350 2026-03-18 12:14 by djl2006
[考研] 299求调剂 +5 △小透明* 2026-03-17 5/250 2026-03-18 11:49 by 尽舜尧1
[考研] 0703化学336分求调剂 +6 zbzihdhd 2026-03-15 7/350 2026-03-18 09:53 by zhukairuo
[考研] 301求调剂 +9 yy要上岸呀 2026-03-17 9/450 2026-03-18 08:58 by 无际的草原
[考研] 326求调剂 +5 上岸的小葡 2026-03-15 6/300 2026-03-17 17:26 by ruiyingmiao
[考研] 本人考085602 化学工程 专硕 +16 不知道叫什么！ 2026-03-15 18/900 2026-03-17 17:05 by ruiyingmiao
[考研] 211本，11408一志愿中科院277分，曾在中科院自动化所实习 +6 Losir 2026-03-12 7/350 2026-03-17 12:09 by danranxie
[考研] 材料工程专硕274一志愿211求调剂 +6 薛云鹏 2026-03-15 6/300 2026-03-17 11:05 by 学员h26Tkc
[考研] 考研调剂 +3 淇ya_~ 2026-03-17 5/250 2026-03-17 09:25 by Winj1e
[考研] 机械专硕325，寻找调剂院校 +3 y9999 2026-03-15 5/250 2026-03-16 19:58 by y9999
[考研] 326求调剂 +4 诺贝尔化学奖觊� 2026-03-15 7/350 2026-03-16 17:11 by 诺贝尔化学奖觊�
[考研] 304求调剂 +4 ahbd 2026-03-14 4/200 2026-03-16 16:48 by 我的船我的海
[考研] 一志愿211 0703方向310分求调剂 +3 努力奋斗112 2026-03-15 3/150 2026-03-16 16:44 by houyaoxu
[考研] 0703化学调剂，求各位老师收留 +8 秋有木北 2026-03-14 8/400 2026-03-16 15:21 by 哦哦123
[考研] 085600材料与化工 求调剂 +13 enenenhui 2026-03-13 14/700 2026-03-16 15:19 by 了了了了。。
[考研] 294求调剂 +3 Zys010410@ 2026-03-13 4/200 2026-03-15 10:59 by zhq0425
[考研] ［0860］321分求调剂，ab区皆可 +4 宝贵热 2026-03-13 4/200 2026-03-13 22:01 by 星空星月
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭