应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 关于二倍体酿酒酵母基因敲除的疑问
51/1返回列表
查看: 3240  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

一休陈

金虫 (正式写手)

[求助] 关于二倍体酿酒酵母基因敲除的疑问 已有2人参与

各位虫友大家新年好。
    我最近开始做二倍体酿酒酵母基因的敲除工作，现在遇到两个疑问：其一，构建一个（上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂）的敲除盒，一次转化，有没有可能将两个等位基因同时敲除？这样的话，我用菌落PCR验证，P不出来目的基因条带的且带有G418抗性的菌落岂不就是敲除的阳性菌落？ 其二，如果第一点不成立，即是一个敲除盒经过一次转化只能敲除一个等位基因的话，第二个基因我怎么敲除呢？还望有二倍体酿酒酵母敲除经验的虫友们多多指教！再次祝福大家新年快乐，马年龙马精神，百尺竿头，更进一步！谢谢。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

蛋白表达纯化鉴定精华

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-02-12 16:12:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

l68266152

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
一休陈: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-02-14 09:03:33
引用回帖:
4楼: Originally posted by 一休陈 at 2014-02-13 15:23:46
那请问我首先通过构建一个（上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂）的敲除盒，第一次转化敲除一个等位基因；然后利用Cre酶切掉G418抗性基因；再在这个目的基因内部区域设计并构建敲除盒，第二进行不完全敲除的话，这 ...

你这两个方案都是可行的，具体的方法还是参照下文献，你用的菌无法分单配体是么？
赞一下 回复此楼
相信自己
7楼2014-02-13 16:33:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 16 个回答

l68266152

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
一休陈: 金币+5, ★有帮助 2014-02-13 15:20:43
基本不会出现同时双敲的情况。只要有一个拷贝就可以获得抗性的情况下，生物不会浪费多余的精力去弄第二个。

后续试验思路：
1、分单倍体；
2、用另外的抗生素标签敲除另一个基因。
赞一下(2人) 回复此楼
相信自己
2楼2014-02-12 16:31:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
一休陈: 金币+5, ★有帮助 2014-02-13 15:44:12
补充一下楼上，首先要把阳性克隆诱导产孢然后用蜗牛酶和纤维素酶处理掉壁，在导致显微镜下分离単孢，在抗生素的培养基上和PCR验证哪两个孢子或四个孢子全部含有抗性基因，将阳性孢子传代，在HO基因的作用下，变成二倍体酵母，即纯合体酵母。
赞一下 回复此楼
3楼2014-02-13 15:21:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

一休陈

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by l68266152 at 2014-02-12 16:31:17
基本不会出现同时双敲的情况。只要有一个拷贝就可以获得抗性的情况下，生物不会浪费多余的精力去弄第二个。

后续试验思路：
1、分单倍体；
2、用另外的抗生素标签敲除另一个基因。

那请问我首先通过构建一个（上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂）的敲除盒，第一次转化敲除一个等位基因；然后利用Cre酶切掉G418抗性基因；再在这个目的基因内部区域设计并构建敲除盒，第二进行不完全敲除的话，这样的可行性大吗？
赞一下 回复此楼
4楼2014-02-13 15:23:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 16 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭