24小时热门版块排行榜

返回列表

beer胖

新虫 (小有名气)

应助: 15 (小学生)
金币: 1496.2
帖子: 146
在线: 83.2小时
虫号: 1305517
注册: 2011-05-25
性别: GG
专业: 微生物生理与生物化学

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
一休陈: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢。还希望以后能够得到您的指教。非常感谢。祝福虫友马年快乐。 2014-02-17 11:02:39

如果二倍体酵母HO基因没有活性的话，就直接先分单倍体，再做基因敲除，而且还可以不用抗性基因，直接用尿嘧啶缺陷型就行；然后再用HO基因恢复为二倍体或两种配型的工程菌交配获得二倍体，单倍体很好分离的，直接生孢后蜗牛酶破壁，涂板筛选就行了。
直接以二倍体进行基因敲除的话，也有可能会产生两个等位基因的敲除，只是概率极低，难度很大。很幸运的是我再敲除二倍体HO基因的时候获得了两个等位基因HO基因均被敲除的突变体。

赞一下

回复此楼

11楼2014-02-17 10:01:22

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

huangzhenjie

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 131.5
帖子: 8
在线: 7.9小时
虫号: 1308806
注册: 2011-05-28
专业: 微生物遗传育种学

楼主你好！实验应该顺利完成了吧。我也还好奇你的第一个疑问。你现在应该知道什么原因了吧。能帮我解惑下吗。还有如果不删除抗性基因直接进行第二次转化，会怎样？

赞一下

回复此楼

12楼2014-07-30 22:39:06

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

一休陈

金虫 (正式写手)

应助: 1 (幼儿园)
金币: 1248.4
散金: 35
红花: 1
帖子: 525
在线: 79.1小时
虫号: 970791
注册: 2010-03-14
性别: GG
专业: 微生物药物

引用回帖:

12楼: Originally posted by huangzhenjie at 2014-07-30 22:39:06
楼主你好！实验应该顺利完成了吧。我也还好奇你的第一个疑问。你现在应该知道什么原因了吧。能帮我解惑下吗。还有如果不删除抗性基因直接进行第二次转化，会怎样？

工业酿酒酵母为二倍体，如果近敲除一次的话，肯定是不可以的。解决方案如下：方案一：如果你只是敲除一个基因的话，那么你可以选择两个抗性基因（比如博来霉素敲除一次，G418敲除一次）设计两组敲除组件，进行两次敲除，这样双抗的即视为完全敲除等位基因。方案2分离单倍体，利用Cre-LoxP敲除质粒，每个基因只敲除一次就可以了；方案三，不去分离单倍体，利用Cre-LoxP敲除质粒，每个基因设计两组敲除组件，都用G418抗性基因，没敲除一次，利用Cre重组酶切掉G418抗性基因，然后进行第二次敲除，这样即得到敲除了等位基因的敲除菌株。我是利用的第三种方案。

赞一下

回复此楼

13楼2014-07-31 10:41:45

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

huangzhenjie

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 131.5
帖子: 8
在线: 7.9小时
虫号: 1308806
注册: 2011-05-28
专业: 微生物遗传育种学

引用回帖:

13楼: Originally posted by 一休陈 at 2014-07-31 10:41:45
工业酿酒酵母为二倍体，如果近敲除一次的话，肯定是不可以的。解决方案如下：方案一：如果你只是敲除一个基因的话，那么你可以选择两个抗性基因（比如博来霉素敲除一次，G418敲除一次）设计两组敲除组件，进行两次 ...

谢谢！其实我们一直也都用第三种方案。但我就是疑惑，为什么一般转一次只能整合一条，是不是二楼回复的跟抗性有关。简单理解整合原理，不是有同源臂就会发生同源重组。？如果跟抗性有关，那跟我之前做通过rDNA介导进行多拷贝没矛盾吗。

赞一下

回复此楼

14楼2014-08-09 12:28:29

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖