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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 关于二倍体酿酒酵母基因敲除的疑问
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beer胖

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
一休陈: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢。还希望以后能够得到您的指教。非常感谢。祝福虫友马年快乐。 2014-02-17 11:02:39
如果二倍体酵母HO基因没有活性的话，就直接先分单倍体，再做基因敲除，而且还可以不用抗性基因，直接用尿嘧啶缺陷型就行；然后再用HO基因恢复为二倍体或两种配型的工程菌交配获得二倍体，单倍体很好分离的，直接生孢后蜗牛酶破壁，涂板筛选就行了。
直接以二倍体进行基因敲除的话，也有可能会产生两个等位基因的敲除，只是概率极低，难度很大。很幸运的是我再敲除二倍体HO基因的时候获得了两个等位基因HO基因均被敲除的突变体。
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11楼2014-02-17 10:01:22
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huangzhenjie

新虫 (初入文坛)
楼主你好！实验应该顺利完成了吧。我也还好奇你的第一个疑问。你现在应该知道什么原因了吧。能帮我解惑下吗。还有如果不删除抗性基因直接进行第二次转化，会怎样？
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12楼2014-07-30 22:39:06
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一休陈

金虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by huangzhenjie at 2014-07-30 22:39:06
楼主你好！实验应该顺利完成了吧。我也还好奇你的第一个疑问。你现在应该知道什么原因了吧。能帮我解惑下吗。还有如果不删除抗性基因直接进行第二次转化，会怎样？

工业酿酒酵母为二倍体，如果近敲除一次的话，肯定是不可以的。解决方案如下：方案一：如果你只是敲除一个基因的话，那么你可以选择两个抗性基因（比如博来霉素敲除一次，G418敲除一次）设计两组敲除组件，进行两次敲除，这样双抗的即视为完全敲除等位基因。方案2分离单倍体，利用Cre-LoxP敲除质粒，每个基因只敲除一次就可以了；方案三，不去分离单倍体，利用Cre-LoxP敲除质粒，每个基因设计两组敲除组件，都用G418抗性基因，没敲除一次，利用Cre重组酶切掉G418抗性基因，然后进行第二次敲除，这样即得到敲除了等位基因的敲除菌株。我是利用的第三种方案。
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13楼2014-07-31 10:41:45
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huangzhenjie

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 一休陈 at 2014-07-31 10:41:45
工业酿酒酵母为二倍体，如果近敲除一次的话，肯定是不可以的。解决方案如下：方案一：如果你只是敲除一个基因的话，那么你可以选择两个抗性基因（比如博来霉素敲除一次，G418敲除一次）设计两组敲除组件，进行两次 ...

谢谢！  其实我们一直也都用第三种方案。但我就是疑惑，为什么一般转一次只能整合一条，是不是二楼回复的跟抗性有关。简单理解整合原理，不是有同源臂就会发生同源重组。？如果跟抗性有关，那跟我之前做通过rDNA介导进行多拷贝没矛盾吗。
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14楼2014-08-09 12:28:29
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huangzhenjie

新虫 (初入文坛)
请问，你转化是用电转吗，转一次就成功吗？我最近做了两三次还不见正常菌落（只有针头大小菌落）。不知道是什么原因，求解？谢谢
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15楼2014-08-20 14:56:51
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cTiyAmo

禁虫
本帖内容被屏蔽
16楼2022-02-28 19:17:19
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