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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 关于二倍体酿酒酵母基因敲除的疑问
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一休陈

金虫 (正式写手)

[求助] 关于二倍体酿酒酵母基因敲除的疑问 已有2人参与

各位虫友大家新年好。
    我最近开始做二倍体酿酒酵母基因的敲除工作，现在遇到两个疑问：其一，构建一个（上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂）的敲除盒，一次转化，有没有可能将两个等位基因同时敲除？这样的话，我用菌落PCR验证，P不出来目的基因条带的且带有G418抗性的菌落岂不就是敲除的阳性菌落？ 其二，如果第一点不成立，即是一个敲除盒经过一次转化只能敲除一个等位基因的话，第二个基因我怎么敲除呢？还望有二倍体酿酒酵母敲除经验的虫友们多多指教！再次祝福大家新年快乐，马年龙马精神，百尺竿头，更进一步！谢谢。
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1楼 2014-02-12 16:12:36
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一休陈

金虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by huangzhenjie at 2014-07-30 22:39:06
楼主你好！实验应该顺利完成了吧。我也还好奇你的第一个疑问。你现在应该知道什么原因了吧。能帮我解惑下吗。还有如果不删除抗性基因直接进行第二次转化，会怎样？

工业酿酒酵母为二倍体，如果近敲除一次的话，肯定是不可以的。解决方案如下：方案一：如果你只是敲除一个基因的话，那么你可以选择两个抗性基因（比如博来霉素敲除一次，G418敲除一次）设计两组敲除组件，进行两次敲除，这样双抗的即视为完全敲除等位基因。方案2分离单倍体，利用Cre-LoxP敲除质粒，每个基因只敲除一次就可以了；方案三，不去分离单倍体，利用Cre-LoxP敲除质粒，每个基因设计两组敲除组件，都用G418抗性基因，没敲除一次，利用Cre重组酶切掉G418抗性基因，然后进行第二次敲除，这样即得到敲除了等位基因的敲除菌株。我是利用的第三种方案。
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13楼2014-07-31 10:41:45
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l68266152

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
一休陈: 金币+5, ★有帮助 2014-02-13 15:20:43
基本不会出现同时双敲的情况。只要有一个拷贝就可以获得抗性的情况下，生物不会浪费多余的精力去弄第二个。

后续试验思路：
1、分单倍体；
2、用另外的抗生素标签敲除另一个基因。
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相信自己
2楼2014-02-12 16:31:17
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yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
一休陈: 金币+5, ★有帮助 2014-02-13 15:44:12
补充一下楼上，首先要把阳性克隆诱导产孢然后用蜗牛酶和纤维素酶处理掉壁，在导致显微镜下分离単孢，在抗生素的培养基上和PCR验证哪两个孢子或四个孢子全部含有抗性基因，将阳性孢子传代，在HO基因的作用下，变成二倍体酵母，即纯合体酵母。
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3楼2014-02-13 15:21:40
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一休陈

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by l68266152 at 2014-02-12 16:31:17
基本不会出现同时双敲的情况。只要有一个拷贝就可以获得抗性的情况下，生物不会浪费多余的精力去弄第二个。

后续试验思路：
1、分单倍体；
2、用另外的抗生素标签敲除另一个基因。

那请问我首先通过构建一个（上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂）的敲除盒，第一次转化敲除一个等位基因；然后利用Cre酶切掉G418抗性基因；再在这个目的基因内部区域设计并构建敲除盒，第二进行不完全敲除的话，这样的可行性大吗？
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4楼2014-02-13 15:23:46
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