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一休陈金虫 (正式写手)
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[求助]
关于二倍体酿酒酵母基因敲除的疑问 已有2人参与
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各位虫友大家新年好。 我最近开始做二倍体酿酒酵母基因的敲除工作，现在遇到两个疑问：其一，构建一个（上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂）的敲除盒，一次转化，有没有可能将两个等位基因同时敲除？这样的话，我用菌落PCR验证，P不出来目的基因条带的且带有G418抗性的菌落岂不就是敲除的阳性菌落？ 其二，如果第一点不成立，即是一个敲除盒经过一次转化只能敲除一个等位基因的话，第二个基因我怎么敲除呢？还望有二倍体酿酒酵母敲除经验的虫友们多多指教！再次祝福大家新年快乐，马年龙马精神，百尺竿头，更进一步！谢谢。 |
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beer胖
新虫 (小有名气)
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【答案】应助回帖
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一休陈: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢。还希望以后能够得到您的指教。非常感谢。祝福虫友马年快乐。 2014-02-17 11:02:39
一休陈: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢。还希望以后能够得到您的指教。非常感谢。祝福虫友马年快乐。 2014-02-17 11:02:39
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如果二倍体酵母HO基因没有活性的话，就直接先分单倍体，再做基因敲除，而且还可以不用抗性基因，直接用尿嘧啶缺陷型就行；然后再用HO基因恢复为二倍体或两种配型的工程菌交配获得二倍体，单倍体很好分离的，直接生孢后蜗牛酶破壁，涂板筛选就行了。 直接以二倍体进行基因敲除的话，也有可能会产生两个等位基因的敲除，只是概率极低，难度很大。很幸运的是我再敲除二倍体HO基因的时候获得了两个等位基因HO基因均被敲除的突变体。 |
11楼2014-02-17 10:01:22
2楼2014-02-12 16:31:17
yuanbo934
至尊木虫 (著名写手)
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3楼2014-02-13 15:21:40
一休陈
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4楼2014-02-13 15:23:46
