24小时热门版块排行榜    

查看: 3917  |  回复: 15
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

一休陈

金虫 (正式写手)

[求助] 关于二倍体酿酒酵母基因敲除的疑问 已有2人参与

各位虫友大家新年好。
    我最近开始做二倍体酿酒酵母基因的敲除工作,现在遇到两个疑问:其一,构建一个(上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂)的敲除盒,一次转化,有没有可能将两个等位基因同时敲除?这样的话,我用菌落PCR验证,P不出来目的基因条带的且带有G418抗性的菌落岂不就是敲除的阳性菌落? 其二,如果第一点不成立,即是一个敲除盒经过一次转化只能敲除一个等位基因的话,第二个基因我怎么敲除呢?还望有二倍体酿酒酵母敲除经验的虫友们多多指教!再次祝福大家新年快乐,马年龙马精神,百尺竿头,更进一步!谢谢。
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huangzhenjie

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
13楼: Originally posted by 一休陈 at 2014-07-31 10:41:45
工业酿酒酵母为二倍体,如果近敲除一次的话,肯定是不可以的。解决方案如下:方案一:如果你只是敲除一个基因的话,那么你可以选择两个抗性基因(比如博来霉素敲除一次,G418敲除一次)设计两组敲除组件,进行两次 ...

谢谢!  其实我们一直也都用第三种方案。但我就是疑惑,为什么一般转一次只能整合一条,是不是二楼回复的跟抗性有关。简单理解整合原理,不是有同源臂就会发生同源重组。?如果跟抗性有关,那跟我之前做通过rDNA介导进行多拷贝没矛盾吗。
14楼2014-08-09 12:28:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 16 个回答

l68266152

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
一休陈: 金币+5, 有帮助 2014-02-13 15:20:43
基本不会出现同时双敲的情况。只要有一个拷贝就可以获得抗性的情况下,生物不会浪费多余的精力去弄第二个。

后续试验思路:
1、分单倍体;
2、用另外的抗生素标签敲除另一个基因。
相信自己
2楼2014-02-12 16:31:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
一休陈: 金币+5, 有帮助 2014-02-13 15:44:12
补充一下楼上,首先要把阳性克隆诱导产孢然后用蜗牛酶和纤维素酶处理掉壁,在导致显微镜下分离単孢,在抗生素的培养基上和PCR验证哪两个孢子或四个孢子全部含有抗性基因,将阳性孢子传代,在HO基因的作用下,变成二倍体酵母,即纯合体酵母。
3楼2014-02-13 15:21:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

一休陈

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by l68266152 at 2014-02-12 16:31:17
基本不会出现同时双敲的情况。只要有一个拷贝就可以获得抗性的情况下,生物不会浪费多余的精力去弄第二个。

后续试验思路:
1、分单倍体;
2、用另外的抗生素标签敲除另一个基因。

那请问我首先通过构建一个(上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂)的敲除盒,第一次转化敲除一个等位基因;然后利用Cre酶切掉G418抗性基因;再在这个目的基因内部区域设计并构建敲除盒,第二进行不完全敲除的话,这样的可行性大吗?
4楼2014-02-13 15:23:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的,真有人买论文么?感觉没必要啊 +3 Tide man 2026-08-10 3/150 2026-08-10 21:48 by GZUZM
[基金申请] FileCode能看出啥? +7 要乐观耀哥 2026-08-10 15/750 2026-08-10 19:29 by 要乐观耀哥
[基金申请] filecode +8 documentary 2026-08-10 8/400 2026-08-10 19:20 by loufangrui
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +3 瞬息宇宙 2026-08-10 3/150 2026-08-10 18:27 by Tide man
[基金申请] 静等基金结果 +5 gjjjzhong 2026-08-10 16/800 2026-08-10 17:19 by Tide man
[基金申请] 我的国基提前知道中了,可是同事的操作让我实在接受不了,怎么会有这样的人 +8 家与远方 2026-08-10 11/550 2026-08-10 17:09 by 六两废铜
[基金申请] 奇怪,两个人的filecode固定段从头到尾一模一样 +4 布布和一二 2026-08-10 4/200 2026-08-10 14:50 by 医学老男孩
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +7 瞬息宇宙 2026-08-10 8/400 2026-08-10 12:42 by Vivilian
[基金申请] 2026国自然放榜时间 +9 布布和一二 2026-08-08 9/450 2026-08-10 11:22 by xxxx2020
[基金申请] 这样的filecode谁见过 +11 布布和一二 2026-08-08 22/1100 2026-08-10 11:10 by wmfsnow
[基金申请] 面上项目filecode邪修 +5 西山十月 2026-08-09 7/350 2026-08-10 07:32 by 仁砚薪传
[基金申请] filecode与中标关系的预测 +5 布布和一二 2026-08-07 5/250 2026-08-09 16:15 by 袁向阳007
[基金申请] 关于豆爷回答的JTJC与%2F数量 +5 yang182083 2026-08-06 7/350 2026-08-08 18:29 by zhanghaozhu
[基金申请] 国基金的申报应该改成非等额制,评价高的钱多评价低的钱少,但是增加资助率 +7 a089 2026-08-07 7/350 2026-08-08 18:05 by gltch
[基金申请] 娱乐 +6 Tide man 2026-08-03 6/300 2026-08-07 22:40 by 铁帽子农民
[基金申请] 听说今天filecode变了 +24 布布和一二 2026-08-06 47/2350 2026-08-07 16:02 by zhiyanjiang
[基金申请] filecode +14 等待解的谜 2026-08-06 19/950 2026-08-07 12:20 by wlwhappy
[基金申请] 影响面上的因素 +8 布布和一二 2026-08-05 11/550 2026-08-06 10:41 by 宝贝虫子
[基金申请] 好消息?这个有何含义??? +8 Tide man 2026-08-05 10/500 2026-08-05 16:14 by xmuxiaoyu
[基金申请] 纯娱乐,不喜欢勿喷 +7 Tide man 2026-08-04 10/500 2026-08-04 15:10 by loufangrui
信息提示
请填处理意见