24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
查看: 3463  |  回复: 15
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

一休陈

金虫 (正式写手)

[求助] 关于二倍体酿酒酵母基因敲除的疑问 已有2人参与

各位虫友大家新年好。
    我最近开始做二倍体酿酒酵母基因的敲除工作,现在遇到两个疑问:其一,构建一个(上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂)的敲除盒,一次转化,有没有可能将两个等位基因同时敲除?这样的话,我用菌落PCR验证,P不出来目的基因条带的且带有G418抗性的菌落岂不就是敲除的阳性菌落? 其二,如果第一点不成立,即是一个敲除盒经过一次转化只能敲除一个等位基因的话,第二个基因我怎么敲除呢?还望有二倍体酿酒酵母敲除经验的虫友们多多指教!再次祝福大家新年快乐,马年龙马精神,百尺竿头,更进一步!谢谢。
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
本帖内容被屏蔽

16楼2022-02-28 19:17:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 16 个回答

l68266152

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
一休陈: 金币+5, 有帮助 2014-02-13 15:20:43
基本不会出现同时双敲的情况。只要有一个拷贝就可以获得抗性的情况下,生物不会浪费多余的精力去弄第二个。

后续试验思路:
1、分单倍体;
2、用另外的抗生素标签敲除另一个基因。
相信自己
2楼2014-02-12 16:31:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuanbo934

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
一休陈: 金币+5, 有帮助 2014-02-13 15:44:12
补充一下楼上,首先要把阳性克隆诱导产孢然后用蜗牛酶和纤维素酶处理掉壁,在导致显微镜下分离単孢,在抗生素的培养基上和PCR验证哪两个孢子或四个孢子全部含有抗性基因,将阳性孢子传代,在HO基因的作用下,变成二倍体酵母,即纯合体酵母。
3楼2014-02-13 15:21:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

一休陈

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by l68266152 at 2014-02-12 16:31:17
基本不会出现同时双敲的情况。只要有一个拷贝就可以获得抗性的情况下,生物不会浪费多余的精力去弄第二个。

后续试验思路:
1、分单倍体;
2、用另外的抗生素标签敲除另一个基因。

那请问我首先通过构建一个(上游同源臂+G418抗性基因+下游同源臂)的敲除盒,第一次转化敲除一个等位基因;然后利用Cre酶切掉G418抗性基因;再在这个目的基因内部区域设计并构建敲除盒,第二进行不完全敲除的话,这样的可行性大吗?
4楼2014-02-13 15:23:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 机械工程313分找工科调剂 +3 双一流本科机械 2026-04-08 3/150 2026-04-08 20:41 by 土木硕士招生
[考研] 293分求调剂,外语为俄语 +7 加一一九 2026-04-07 10/500 2026-04-08 20:14 by yutian743
[考研] 求调剂 +14 张zic 2026-04-05 15/750 2026-04-08 16:14 by 一只好果子?
[考研] 一志愿哈工大,初试329,求环境科学与工程调剂! +11 余未辛 2026-04-06 11/550 2026-04-08 15:21 by screening
[考研] 0703化学调剂325分 +13 15771691647 2026-04-04 14/700 2026-04-08 10:28 by screening
[考研] 315求调剂 +17 小羊小羊_ 2026-04-02 18/900 2026-04-07 22:01 by lijunpoly
[考研] 307求调剂 +3 Youth@@ 2026-04-07 3/150 2026-04-07 22:00 by hemengdong
[考研] 材料工程302分求调剂 +13 zyx上岸! 2026-04-04 13/650 2026-04-07 11:14 by 诗与自由
[考研] 08专硕275调剂 +5 AaAa7420 2026-04-05 5/250 2026-04-05 18:01 by jkddd
[考研] 341求调剂 +3 学无止境,冲 2026-04-05 3/150 2026-04-05 09:40 by lbsjt
[考研] 考研调剂 +5 四川王涛 2026-04-04 5/250 2026-04-04 22:18 by 啵啵啵0119
[考研] 342求调剂 +3 Liang7111 2026-04-04 5/250 2026-04-04 19:47 by dongzh2009
[考研] 359求调剂 +7 hhhhaaaa$ 2026-04-04 7/350 2026-04-04 18:49 by imissbao
[考研] 292求调剂 +11 2022080213 2026-04-04 13/650 2026-04-04 18:38 by macy2011
[考研] 325求调剂 +4 春风不借意 2026-04-04 4/200 2026-04-04 14:46 by 湘农储能材料
[考研] 22408求调剂 354分 可跨专业 +3 hannnnnnn 2026-04-04 3/150 2026-04-04 14:35 by 土木硕士招生
[考研] 一志愿沪985,326分求调剂 +3 刘墨墨 2026-04-03 3/150 2026-04-04 11:16 by 悲伤的芋头
[考研] 268求调剂 +8 你好tg 2026-04-03 9/450 2026-04-04 05:08 by gswylq
[考研] 材料科学与工程考研 +10 拯救皮特托先生 2026-04-02 10/500 2026-04-03 23:57 by userper
[考研] 土木304求调剂 +4 兔突突突, 2026-04-02 5/250 2026-04-02 21:16 by 兔突突突,
信息提示
请填处理意见