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菌液PCR的结果显示：阳性克隆较少，且目的条带比较浅 已有3人参与
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我的步骤是：我用TAKARA的primerstar扩的PCR产物（877bp，高GC序列 98℃ 5min，98℃ 10s，68℃ 1min10s，30cycles，72 ℃ 10min，12℃ forever），跑胶看了一下，条带挺亮，然后纯化，用TAKARA的EX Taq加A（24.2ul DNA ,3ul 10×EX Taq BUFFER ，2.5ul 2.5mM dATP 0.3ul EX Taq 70℃ 30min）再进行纯化，按照北京全式金试剂盒的说明书进行TA克隆（5ul体系，37 ℃ 10min），然后转化（感受态细胞用的是试剂盒里自带的）涂板，37℃培养过夜，挑单菌落于10ul LB+AMP培养1h，取1ul菌液做模板用TAKARA的rTaq进行PCR（98℃ 5min ，98℃ 10s ，55℃ 30s， 72℃ 1min10s ，30cycles 72 ℃ 10min，12℃ forever ）,但是现在的问题是：不仅阳性克隆比较少，而且阳性克隆的目的条带比较浅。 备注：纯化以及转化步骤和大众的相同，菌液PCR跑出的胶图中可以看出：不仅阳性克隆比较少，而且阳性克隆的目的条带比较浅，选了几个单一条带的管号去测序，结果是好的，但我想知道为什么假阳性这么高，而且条带比较浅。希望各位帮帮忙！谢谢 |
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2015-08-29 10:23:04, 9.63 M
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10楼2015-09-03 21:26:05
18761615793
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11楼2015-09-06 09:40:01
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-09-03 23:01:42
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-09-03 23:01:42
| 目的条带浅，好歹也出来啦，说明在摸索摸索条件优化优化就能出来了，至于假阳性问题，你是和正对照比出的结果吧？原因很多啊，模板有Taq酶抑制剂，引物设计不合理退火温度延伸时间等，你得自己一一排除啊，上张图上来可能会好分析一点，这些资料上多有的http://www.detaibio.com/topics/pcr-faq-specific-amplify.html |
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