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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 菌液PCR的结果显示：阳性克隆较少，且目的条带比较浅
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1297286362

铜虫 (初入文坛)

[求助] 菌液PCR的结果显示：阳性克隆较少，且目的条带比较浅已有3人参与

我的步骤是：我用TAKARA的primerstar扩的PCR产物（877bp，高GC序列 98℃ 5min，98℃ 10s，68℃ 1min10s，30cycles，72 ℃ 10min，12℃ forever），跑胶看了一下，条带挺亮，然后纯化，用TAKARA的EX Taq加A（24.2ul DNA ,3ul 10×EX Taq BUFFER ，2.5ul 2.5mM dATP 0.3ul EX Taq 70℃ 30min）再进行纯化，按照北京全式金试剂盒的说明书进行TA克隆（5ul体系，37 ℃ 10min），然后转化（感受态细胞用的是试剂盒里自带的）涂板，37℃培养过夜，挑单菌落于10ul LB+AMP培养1h，取1ul菌液做模板用TAKARA的rTaq进行PCR（98℃ 5min ，98℃ 10s ，55℃ 30s， 72℃ 1min10s ，30cycles 72 ℃ 10min，12℃ forever ）,但是现在的问题是：不仅阳性克隆比较少，而且阳性克隆的目的条带比较浅。
备注：纯化以及转化步骤和大众的相同，菌液PCR跑出的胶图中可以看出：不仅阳性克隆比较少，而且阳性克隆的目的条带比较浅，选了几个单一条带的管号去测序，结果是好的，但我想知道为什么假阳性这么高，而且条带比较浅。希望各位帮帮忙！谢谢
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1楼2015-08-29 11:57:02
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1297286362

铜虫 (初入文坛)
亲们，我找到原因了，我的PCR产物是高GC序列，做菌液PCR时一般的酶扩增的效果不好，我使用了primeSTAR,效果非常好，如果遇到类似的 问题可以借鉴一下。
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10楼2015-09-03 21:26:05
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by 1297286362 at 2015-09-03 21:26:05
亲们，我找到原因了，我的PCR产物是高GC序列，做菌液PCR时一般的酶扩增的效果不好，我使用了primeSTAR,效果非常好，如果遇到类似的 问题可以借鉴一下。

哎，其实问题都很简单，只是一个酶，有的时候做实验久了，往往就不喜欢考虑最简单的原因了~还是优化体系，摸索条件，扩增当然不要用普通的酶了，我们都用热启动酶，或者热启动高保真酶，你的模板GC含量高，当然更不选择一般的酶了，楼主有待了解更多的酶种类啊，选择，适用性等等
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
11楼2015-09-06 09:40:01
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普通回帖

18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-09-03 23:01:42
目的条带浅，好歹也出来啦，说明在摸索摸索条件优化优化就能出来了，至于假阳性问题，你是和正对照比出的结果吧？原因很多啊，模板有Taq酶抑制剂，引物设计不合理退火温度延伸时间等，你得自己一一排除啊，上张图上来可能会好分析一点，这些资料上多有的http://www.detaibio.com/topics/pcr-faq-specific-amplify.html
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2楼2015-09-01 10:21:15
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xiaomili1206

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-03 23:02:00
测序结果对的那几管菌液就是转化成功有目的基因的菌液，扩大培养，调整好细菌状态就可以保存菌种了。扩增阳性和测序正确，这不叫假阳性啊，这就是阳性结果了。英格恩技术博客。
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3楼2015-09-01 11:00:00
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1297286362

铜虫 (初入文坛)
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4楼2015-09-02 16:37:22
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1297286362

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xiaomili1206 at 2015-09-01 11:00:00
测序结果对的那几管菌液就是转化成功有目的基因的菌液，扩大培养，调整好细菌状态就可以保存菌种了。扩增阳性和测序正确，这不叫假阳性啊，这就是阳性结果了。英格恩技术博客。

亲，是我说错了，我想说的是空载率比较高，我做了几次都是这样，有母的条带的比较少，而且还有杂带，请问这是什么原因？
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5楼2015-09-02 16:41:43
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

结果挺好的，很正常
胶底下有些引物二聚体之类的会影响PCR效率
一个就够用了，要那么多干什么
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
6楼2015-09-03 09:19:36
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Eternity宇

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
7楼2015-09-03 11:22:29
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1297286362

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Eternity宇 at 2015-09-03 11:22:29
摇一小时，时间过短了，菌液浓度可能太低……

亲，我找见原因了，我的PCR产物是高GC序列，做菌液PCR时一般的酶扩增的效果不好，我使用了primeSTAR,效果非常好，同样谢谢您的关注！
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8楼2015-09-03 21:24:41
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1297286362

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2015-09-03 09:19:36
结果挺好的，很正常
胶底下有些引物二聚体之类的会影响PCR效率
一个就够用了，要那么多干什么

亲，我找到原因了，我的PCR产物是高GC序列，做菌液PCR时一般的酶扩增的效果不好，我使用了primeSTAR,效果非常好，同样谢谢您的关注！
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9楼2015-09-03 21:25:26
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