| 查看: 3513 | 回复: 12 | ||
[求助]
菌液PCR的结果显示：阳性克隆较少，且目的条带比较浅 已有3人参与
|
||
|
我的步骤是：我用TAKARA的primerstar扩的PCR产物（877bp，高GC序列 98℃ 5min，98℃ 10s，68℃ 1min10s，30cycles，72 ℃ 10min，12℃ forever），跑胶看了一下，条带挺亮，然后纯化，用TAKARA的EX Taq加A（24.2ul DNA ,3ul 10×EX Taq BUFFER ，2.5ul 2.5mM dATP 0.3ul EX Taq 70℃ 30min）再进行纯化，按照北京全式金试剂盒的说明书进行TA克隆（5ul体系，37 ℃ 10min），然后转化（感受态细胞用的是试剂盒里自带的）涂板，37℃培养过夜，挑单菌落于10ul LB+AMP培养1h，取1ul菌液做模板用TAKARA的rTaq进行PCR（98℃ 5min ，98℃ 10s ，55℃ 30s， 72℃ 1min10s ，30cycles 72 ℃ 10min，12℃ forever ）,但是现在的问题是：不仅阳性克隆比较少，而且阳性克隆的目的条带比较浅。 备注：纯化以及转化步骤和大众的相同，菌液PCR跑出的胶图中可以看出：不仅阳性克隆比较少，而且阳性克隆的目的条带比较浅，选了几个单一条带的管号去测序，结果是好的，但我想知道为什么假阳性这么高，而且条带比较浅。希望各位帮帮忙！谢谢 |
回复此楼» 本帖附件资源列表
-
欢迎监督和反馈：小木虫仅提供交流平台，不对该内容负责。
本内容由用户自主发布，如果其内容涉及到知识产权问题，其责任在于用户本人，如对版权有异议，请联系邮箱：xiaomuchong@tal.com - 附件 1 : 20150820-HEG1_clony_PCR_A1-A10_S1-S10.png
- 附件 2 : pEASY-T1_Simple_Cloning_Kit.pdf
- 附件 3 : 20150821-HEG1_clony_PCR_(S1-S26_A1-A15).tif
2015-08-29 10:04:01, 2.94 M
2015-08-29 10:11:07, 2.93 M
2015-08-29 10:23:04, 9.63 M
» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有284人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 菌液测序结果全是非单克隆，求助分析
已经有7人回复
- 重组质粒的验证
已经有15人回复
- 重组质粒转化后提的平板有很多菌落，但是菌落PCR 没有结果。
已经有6人回复
- 重组质粒转化后提的平板有很多菌落，但是菌落PCR 没有结果。
已经有5人回复
- 菌液PCR鉴定阳性，双酶切无结果。
已经有2人回复
- 空白对照怎么都有条带
已经有1人回复
- 连接载体转化后挑单菌落，菌落pcr扩出条带，但是摇菌摇不起来
已经有5人回复
- 载体构建，测序结果显示目的基因全突变，克隆入T载体，菌液PCR全是假阳性
已经有11人回复
- 折磨了一个月的测序-重叠峰问题！
已经有3人回复
- 一个平板上挑取不同菌落得到的测序结果不一样
已经有15人回复
- 酶切验证结果分析
已经有1人回复
- 测序结果显示多了一个碱基，峰图上正常，请问什么原因？谢谢
已经有8人回复
- 【求助/交流】PCR电泳结果疑问
已经有13人回复
10楼2015-09-03 21:26:05
18761615793
木虫 (正式写手)
小虫
- MolEPI: 1
- 应助: 172 (高中生)
- 金币: 646.4
- 散金: 170
- 红花: 16
- 帖子: 863
- 在线: 144.9小时
- 虫号: 3603131
- 注册: 2014-12-19
- 专业: 抗体工程学
11楼2015-09-06 09:40:01
18761615793
木虫 (正式写手)
小虫
- MolEPI: 1
- 应助: 172 (高中生)
- 金币: 646.4
- 散金: 170
- 红花: 16
- 帖子: 863
- 在线: 144.9小时
- 虫号: 3603131
- 注册: 2014-12-19
- 专业: 抗体工程学
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-09-03 23:01:42
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-09-03 23:01:42
| 目的条带浅，好歹也出来啦，说明在摸索摸索条件优化优化就能出来了，至于假阳性问题，你是和正对照比出的结果吧？原因很多啊，模板有Taq酶抑制剂，引物设计不合理退火温度延伸时间等，你得自己一一排除啊，上张图上来可能会好分析一点，这些资料上多有的http://www.detaibio.com/topics/pcr-faq-specific-amplify.html |
2楼2015-09-01 10:21:15
3楼2015-09-01 11:00:00
4楼2015-09-02 16:37:22
5楼2015-09-02 16:41:43
6楼2015-09-03 09:19:36
|
本帖内容被屏蔽 |
7楼2015-09-03 11:22:29
8楼2015-09-03 21:24:41
9楼2015-09-03 21:25:26
20