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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重组质粒的验证
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wuyuanqing

金虫 (正式写手)

[求助] 重组质粒的验证 已有2人参与

各位大侠，本人最近做一个克隆，转化后挑取单克隆，LB摇菌后，进行菌液PCR，引物为我克隆基因的上下游引物，结果显示，有两个克隆出现目的大小条带，而且亮度很大（远远高于marker中最亮的条带），于是信心满满地提取质粒进行酶切验证，结果，电泳显示无任何条带，将质粒上样后也五条带，怀疑是试剂盒的问题后，换一种试剂盒提取，提取物上样电泳显示，没有质粒。这是为什么呢？请赐教，谢谢！
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1楼 2015-10-24 02:19:51
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

q120465872

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我来完整解答你的问题。
首先，你的菌液PCR设计方式不对。从连接转化到挑单克隆菌液PCR这一套完整流程走下来，你最开始做连接的PCR产物还是残留在体系里的，他们并没有反应完全，可能随后续的操作一直存在于体系中（注意是可能，不是一定，不要钻牛角尖啊，）， 仅凭你枪头的触碰就足够进入你菌液PCR的体系成为模板被扩增出来。要充分注意PCR的灵敏度，即使稀释百万倍，轻微触碰，都可能被检测出来，造成判断失误（血泪教训啊）
所以，你在设计菌液PCR验证的时候必须避开这个问题，避免被残留的可能存在的成分干扰你的判断。一般载体引物一对+PCR产物本身引物一对嵌套检测是比较靠谱的，出来两个条带如果差异大小正确基本就不会出问题了。
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wuyuanqing
赐予我力量，去改变我所能改变的；赐予我勇气，去接受我所不能改变的；并赐予我智慧，去分辨这两者。
9楼2015-10-24 20:02:00
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wuyuanqing

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ssswzf at 2015-10-24 17:19:38
提取的质粒是不是这样子的啊？下图都是质粒的提取图片
我也感觉很奇怪，换其他的质粒都可以，就这个这么调皮
TOP10 提取puc质粒，碱裂解

20151023.jpg
...

不是，提取的根本没有质粒

发自小木虫Android客户端
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8楼2015-10-24 19:00:50
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普通回帖

tolobio

新虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
nono2009: 金币-20, 屏蔽内容, 违规存档, 禁止回帖广告 2015-10-25 09:55:20
本帖内容被屏蔽
2楼2015-10-24 06:32:26
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
http://www.dxy.cn/bbs/thread/31813222#31813222
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wuyuanqing
3楼2015-10-24 12:22:08
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wxb2061

银虫 (小有名气)
内容已删除
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走在途中……
4楼2015-10-24 14:03:02
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tolobio

新虫 (小有名气)
商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
引用回帖:
4楼: Originally posted by wxb2061 at 2015-10-24 14:03:02
都给你们做了，又怎样来锻炼
...

有道理。建议等锻炼好之后，如果同意质粒构建是重复、机械劳动的话，可以联系我们。
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5楼2015-10-24 14:12:29
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ssswzf

金虫 (小有名气)
提取的质粒是不是这样子的啊？下图都是质粒的提取图片
我也感觉很奇怪，换其他的质粒都可以，就这个这么调皮
TOP10 提取puc质粒，碱裂解
重组质粒的验证
20151023.jpg
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6楼2015-10-24 17:19:38
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wuyuanqing

金虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2015-10-24 12:22:08
http://www.dxy.cn/bbs/thread/31813222#31813222

谢谢！

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7楼2015-10-24 19:00:12
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wuyuanqing

金虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by q120465872 at 2015-10-24 20:02:00
我来完整解答你的问题。
首先，你的菌液PCR设计方式不对。从连接转化到挑单克隆菌液PCR这一套完整流程走下来，你最开始做连接的PCR产物还是残留在体系里的，他们并没有反应完全，可能随后续的操作一直存在于体系中 ...

谢谢你的建议，我这是连续做了五个克隆后第六个出现这个问题，一直想不通，看来以后需要这样设计引物了。另外请教一下，如果是残留，为何会在抗性培养基里生长却没有质粒？

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10楼2015-10-24 20:06:44
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