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wuyuanqing

金虫 (正式写手)

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专业: 微生物遗传育种学

[求助] 重组质粒的验证已有2人参与

各位大侠，本人最近做一个克隆，转化后挑取单克隆，LB摇菌后，进行菌液PCR，引物为我克隆基因的上下游引物，结果显示，有两个克隆出现目的大小条带，而且亮度很大（远远高于marker中最亮的条带），于是信心满满地提取质粒进行酶切验证，结果，电泳显示无任何条带，将质粒上样后也五条带，怀疑是试剂盒的问题后，换一种试剂盒提取，提取物上样电泳显示，没有质粒。这是为什么呢？请赐教，谢谢！

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1楼 2015-10-24 02:19:51

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q120465872

金虫 (小有名气)

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专业: 环境微生物学

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

我来完整解答你的问题。
首先，你的菌液PCR设计方式不对。从连接转化到挑单克隆菌液PCR这一套完整流程走下来，你最开始做连接的PCR产物还是残留在体系里的，他们并没有反应完全，可能随后续的操作一直存在于体系中（注意是可能，不是一定，不要钻牛角尖啊，

），仅凭你枪头的触碰就足够进入你菌液PCR的体系成为模板被扩增出来。要充分注意PCR的灵敏度，即使稀释百万倍，轻微触碰，都可能被检测出来，造成判断失误（血泪教训啊）
所以，你在设计菌液PCR验证的时候必须避开这个问题，避免被残留的可能存在的成分干扰你的判断。一般载体引物一对+PCR产物本身引物一对嵌套检测是比较靠谱的，出来两个条带如果差异大小正确基本就不会出问题了。