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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 这是重组后的验证
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ruchang2013

铁虫 (初入文坛)

[求助] 这是重组后的验证 已有1人参与

这是pTKIP-cat与一段2.3kb的核酸片段做的重组工作，图为PCR验证及酶切验证。
IP1/glk2、galP1/IP2这2对引物，若重组成功，应该有1.5kb左右的条带，显然这样大小的条带不存在，说明重组失败，那为什么会存在大条带？
“对”为pTKIP-cat,若重组成功，重组质粒是7kb

这是重组后的验证
2014.0427 17菌PCR酶切.png
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1楼 2014-05-12 10:47:11
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ruchang2013(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-12 17:58:15
ruchang2013: 金币+3, 谢谢，是不是酶切时间也过短啊！我这次将质粒重新酶切观察到2条带，一条在3kb~5kb,另一条带在2kb~3kb，质粒本身是4kb。我一般酶切3~4h。或者体系不对？我是20μL加0.5μL的酶。 2014-05-13 16:48:57
引物与重组质粒其他位置发生的非特异结合，有大条带很正常~
你的marker最大量程是5K而你的重组质粒是7K？marker不太合适，换一个更大一些的吧。不过从图上看连的不是你的基因，酶切偏小，PCR也没有，重组失败。~
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大家相互帮助哈
2楼2014-05-12 15:13:20
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luwei13566

木虫 (正式写手)
你是双酶切还是单酶切验证的？BglII和ApaI？？pTKIP载体上好像没有BglII切割位点把。。
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大家相互帮助哈
3楼2014-05-13 17:43:45
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906394648

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-06-01 16:58:21
用质粒跑胶理论上会出现三条带，一条是你说的7k的，还有一条是超螺旋结构的，应该是乘以0.6后的4.2k，还有一条是间于这两条带之间的，有可能是双链有可能是半螺旋。
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4楼2014-05-13 19:52:51
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luwei13566

木虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2014-06-01 16:58:29
我一般都是20ul加1ul酶 37度4个小时。
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ruchang2013
大家相互帮助哈
5楼2014-05-13 20:52:37
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ruchang2013

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-05-13 17:43:45
你是双酶切还是单酶切验证的？BglII和ApaI？？pTKIP载体上好像没有BglII切割位点把。。

核算片段上有BglII位点，用BglII，那就是单酶切验证了。ApaI是双酶切验证，因为在pTKIP上ApaI酶切后，插入核算片段，那么酶切验证用此酶时就是双酶切验证啦
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6楼2014-05-14 14:34:26
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ruchang2013

铁虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-05-13 20:52:37
我一般都是20ul加1ul酶 37度4个小时。

谢谢，那么过夜酶切没影响吧，酶切不能超过多长时间啊
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7楼2014-05-14 14:35:27
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luwei13566

木虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-06-01 16:58:57
引用回帖:
6楼: Originally posted by ruchang2013 at 2014-05-14 14:34:26
核算片段上有BglII位点，用BglII，那就是单酶切验证了。ApaI是双酶切验证，因为在pTKIP上ApaI酶切后，插入核算片段，那么酶切验证用此酶时就是双酶切验证啦...

双酶切验证只需要看看你的两条带的大小是否一致即可。至于酶切时间不同公司的效果不一样，而且你用的buffer一致的话还好，如果本身就不太兼容的话还是不要过夜切了。Takara的内切酶我最高试过37度6个小时，如果过夜的话不要有37度了，容易切碎，16度或者25度过夜比较合适
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大家相互帮助哈
8楼2014-05-14 15:27:23
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