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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大肠杆菌转化的奇怪问题
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jordanlang

金虫 (小有名气)

[求助] 大肠杆菌转化的奇怪问题

从E.coli JM109中提取的质粒再转化到DH5α中却怎么都转不进去，质粒是pMD19-T，求各位高手帮助啊！！！
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1楼2013-03-01 10:23:37
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scilencing

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
问题可能出在你提取的质粒上，最好用质粒提取试剂盒来提取质粒。
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2楼2013-03-01 10:44:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
确定感受态没有问题吗？
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3楼2013-03-01 11:21:22
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
jordanlang: 金币+1, ★有帮助 2013-03-02 07:49:39
转不进去是什么意思？涂板过夜后没有克隆吗？
觉得可能的原因有：
1. 感受态是否正常？可以拿control plasmid试一下
2. 抗生素是否用错？
3. 提取质粒的浓度？有时候我们提出来质粒，用nanodrop测试三四十或者四五十ng/ul，但是酶切和测序却发现什么都没有。因此，是否已经检测提取出来的质粒是否正常？
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4楼2013-03-01 17:06:23
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崔士元

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
质粒浓度和质粒纯度都影响转化
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男人，就要对自己狠一点！
5楼2013-03-01 19:22:50
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jordanlang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-01 11:21:22
确定感受态没有问题吗？

感受态没有问题，用别的质粒做了对照，转化效率很高
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6楼2013-03-02 07:40:20
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jordanlang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by scilencing at 2013-03-01 10:44:52
问题可能出在你提取的质粒上，最好用质粒提取试剂盒来提取质粒。

就是用试剂盒提的，提的质量应该不错，浓度比较高，而且也酶切验证了
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7楼2013-03-02 07:41:43
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jordanlang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2013-03-01 17:06:23
转不进去是什么意思？涂板过夜后没有克隆吗？
觉得可能的原因有：
1. 感受态是否正常？可以拿control plasmid试一下
2. 抗生素是否用错？
3. 提取质粒的浓度？有时候我们提出来质粒，用nanodrop测试三四十或者四 ...

就是过夜没有克隆。
感受态应该没问题，control正常
提的质粒也酶切验证了，没问题。
现在有一个问题就是质粒是公司合成的，pMD19-T-simple加上我需要的外源基因，pMD19-T-simple本身没有酶切位点，所以我只能用自己加的酶切位点验证，不知道载体本身有没有问题
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8楼2013-03-02 07:49:25
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scilencing

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

1、质粒合成公司是否提供给你这个质粒的测序结果？还是提供给你该质粒的序列信息？
2、提取质粒的质量很重要，混有杂质是酶切、电泳与测浓度没法检测出来的。
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9楼2013-03-02 09:13:21
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