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wuyuanqing

金虫 (正式写手)

[求助] 重组质粒的验证 已有2人参与

各位大侠,本人最近做一个克隆,转化后挑取单克隆,LB摇菌后,进行菌液PCR,引物为我克隆基因的上下游引物,结果显示,有两个克隆出现目的大小条带,而且亮度很大(远远高于marker中最亮的条带),于是信心满满地提取质粒进行酶切验证,结果,电泳显示无任何条带,将质粒上样后也五条带,怀疑是试剂盒的问题后,换一种试剂盒提取,提取物上样电泳显示,没有质粒。这是为什么呢?请赐教,谢谢!
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wuyuanqing

金虫 (正式写手)

送红花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by q120465872 at 2015-10-24 20:02:00
我来完整解答你的问题。
首先,你的菌液PCR设计方式不对。从连接转化到挑单克隆菌液PCR这一套完整流程走下来,你最开始做连接的PCR产物还是残留在体系里的,他们并没有反应完全,可能随后续的操作一直存在于体系中 ...

谢谢你的建议,我这是连续做了五个克隆后第六个出现这个问题,一直想不通,看来以后需要这样设计引物了。另外请教一下,如果是残留,为何会在抗性培养基里生长却没有质粒?

发自小木虫Android客户端
10楼2015-10-24 20:06:44
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1

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3楼2015-10-24 12:22:08
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tolobio

新虫 (小有名气)


商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
引用回帖:
4楼: Originally posted by wxb2061 at 2015-10-24 14:03:02
都给你们做了,又怎样来锻炼
...

有道理。建议等锻炼好之后,如果同意质粒构建是重复、机械劳动的话,可以联系我们。
5楼2015-10-24 14:12:29
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ssswzf

金虫 (小有名气)


提取的质粒是不是这样子的啊?下图都是质粒的提取图片
我也感觉很奇怪,换其他的质粒都可以,就这个这么调皮
TOP10 提取puc质粒,碱裂解
重组质粒的验证
20151023.jpg

6楼2015-10-24 17:19:38
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