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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 怎么判断重组质粒上的片段成功插入基因组
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杨柳依依625

铁虫 (小有名气)

[求助] 怎么判断重组质粒上的片段成功插入基因组 已有1人参与

我现在需要把构建的重组质粒上的片段插入到基因组，目的基因两端有同源臂（淀粉酶基因），所以可以看淀粉平板上的透明圈来筛选。
我用目的基因的引物扩增重组菌能扩出来目的基因，淀粉酶基因的引物做PCR也显示有片段插入
然后选这两对引物的其中一条配对做PCR，却得不到条带。
不知道我这种验证方法对不对，我还要不要继续验证下去
要怎样才能进一步验证目的基因成功插入到基因组中？
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Lulu与璐璐

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1楼 2015-06-25 15:42:04
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-29 23:00:56
在目的基因上下游基因组选择引物pcr

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2楼2015-06-25 19:54:06
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-29 23:01:09
杨柳依依625: 金币+1, ★有帮助 2015-07-03 20:41:25
插入位置的上下游设计引物进行PCR鉴定。
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3楼2015-06-25 20:35:35
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杨柳依依625

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by guoqin_shiyin at 2015-06-25 19:54:06
在目的基因上下游基因组选择引物pcr

我有做这个，PCR产物确实比原来的要长（我是直接把菌水煮过后做的模板，不知道这样模板会不会不纯）
有文献上说这两对引物各选择一条配对做PCR，可是这个我怎么也做不出来，不知道是为什么
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4楼2015-06-29 21:35:56
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杨柳依依625

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lxj341401 at 2015-06-25 20:35:35
插入位置的上下游设计引物进行PCR鉴定。

这个我鉴定过了，确实比原来的片段要长
那我直接水煮的方法处理菌液做PCR模板会影响纯度吗？
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5楼2015-06-29 21:37:20
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 杨柳依依625 at 2015-06-29 21:37:20
这个我鉴定过了，确实比原来的片段要长
那我直接水煮的方法处理菌液做PCR模板会影响纯度吗？...

不会，我们都是这样做的

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6楼2015-06-29 22:51:45
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杨柳依依625

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by guoqin_shiyin at 2015-06-29 22:51:45
不会，我们都是这样做的
...

那会不会因为之前有导入质粒而有假阳性出现呢？
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7楼2015-06-30 12:24:12
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 杨柳依依625 at 2015-06-30 12:24:12
那会不会因为之前有导入质粒而有假阳性出现呢？...

不会，因为你用的是基因组上下游引物

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8楼2015-06-30 16:28:21
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杨柳依依625

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by guoqin_shiyin at 2015-06-30 16:28:21
不会，因为你用的是基因组上下游引物
...

我还想问个问题，我能用这组引物的上游和我的目的基因引物的下游配对做PCR吗？
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9楼2015-06-30 18:40:08
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 杨柳依依625 at 2015-06-30 18:40:08
我还想问个问题，我能用这组引物的上游和我的目的基因引物的下游配对做PCR吗？...

可以

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10楼2015-06-30 19:53:30
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