应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 菌液PCR的结果显示：阳性克隆较少，且目的条带比较浅
51/1返回列表
查看: 3545  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

1297286362

铜虫 (初入文坛)

[求助] 菌液PCR的结果显示：阳性克隆较少，且目的条带比较浅 已有3人参与

我的步骤是：我用TAKARA的primerstar扩的PCR产物（877bp，高GC序列 98℃ 5min，98℃ 10s，68℃ 1min10s，30cycles，72 ℃ 10min，12℃ forever），跑胶看了一下，条带挺亮，然后纯化，用TAKARA的EX Taq加A（24.2ul DNA ,3ul 10×EX Taq BUFFER ，2.5ul 2.5mM dATP 0.3ul EX Taq 70℃ 30min）再进行纯化，按照北京全式金试剂盒的说明书进行TA克隆（5ul体系，37 ℃ 10min），然后转化（感受态细胞用的是试剂盒里自带的）涂板，37℃培养过夜，挑单菌落于10ul LB+AMP培养1h，取1ul菌液做模板用TAKARA的rTaq进行PCR（98℃ 5min ，98℃ 10s ，55℃ 30s， 72℃ 1min10s ，30cycles 72 ℃ 10min，12℃ forever ）,但是现在的问题是：不仅阳性克隆比较少，而且阳性克隆的目的条带比较浅。
备注：纯化以及转化步骤和大众的相同，菌液PCR跑出的胶图中可以看出：不仅阳性克隆比较少，而且阳性克隆的目的条带比较浅，选了几个单一条带的管号去测序，结果是好的，但我想知道为什么假阳性这么高，而且条带比较浅。希望各位帮帮忙！谢谢
回复此楼

» 本帖附件资源列表

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
喜欢你就诅咒你！
1楼 2015-08-29 11:57:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

1297286362

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Eternity宇 at 2015-09-03 11:22:29
摇一小时，时间过短了，菌液浓度可能太低……

亲，我找见原因了，我的PCR产物是高GC序列，做菌液PCR时一般的酶扩增的效果不好，我使用了primeSTAR,效果非常好，同样谢谢您的关注！
赞一下 回复此楼
喜欢你就诅咒你！
8楼2015-09-03 21:24:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答

18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-09-03 23:01:42
目的条带浅，好歹也出来啦，说明在摸索摸索条件优化优化就能出来了，至于假阳性问题，你是和正对照比出的结果吧？原因很多啊，模板有Taq酶抑制剂，引物设计不合理退火温度延伸时间等，你得自己一一排除啊，上张图上来可能会好分析一点，这些资料上多有的http://www.detaibio.com/topics/pcr-faq-specific-amplify.html
赞一下 回复此楼
todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
2楼2015-09-01 10:21:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiaomili1206

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-03 23:02:00
测序结果对的那几管菌液就是转化成功有目的基因的菌液，扩大培养，调整好细菌状态就可以保存菌种了。扩增阳性和测序正确，这不叫假阳性啊，这就是阳性结果了。英格恩技术博客。
赞一下 回复此楼
3楼2015-09-01 11:00:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

1297286362

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xiaomili1206 at 2015-09-01 11:00:00
测序结果对的那几管菌液就是转化成功有目的基因的菌液，扩大培养，调整好细菌状态就可以保存菌种了。扩增阳性和测序正确，这不叫假阳性啊，这就是阳性结果了。英格恩技术博客。

亲，是我说错了，我想说的是空载率比较高，我做了几次都是这样，有母的条带的比较少，而且还有杂带，请问这是什么原因？
赞一下 回复此楼
喜欢你就诅咒你！
5楼2015-09-02 16:41:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 要骂人了，新模版改版就是要淡化问题凝练这种虚的东西，结果有个评委还在说凝练得不够 +6 瞬息宇宙 2026-08-31 12/600 2026-09-02 10:49 by 瞬息宇宙
[基金申请] 科研人应该花精力去思考如何解决问题，而不是去凝练问题 +4 瞬息宇宙 2026-09-01 8/400 2026-09-02 10:35 by 瞬息宇宙
[基金申请] 我不理解！ +16 Edward_pc 2026-08-26 24/1200 2026-09-02 10:32 by newfuzzy1
[基金申请] 学科评审组评审是指会评吗？ +5 瞬息宇宙 2026-08-31 5/250 2026-09-02 10:13 by 雨冰共舞
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 (金币+15) +17 晴天加油 2026-08-26 19/950 2026-09-02 10:07 by 奶奶的心意
[文学芳草园] 梦想 +5 myrtle 2026-08-26 8/400 2026-09-02 02:42 by Leogzhya
[基金申请] 面上合作单位盖章 +6 ssyjh 2026-08-27 9/450 2026-09-01 20:01 by huagongfeihu
[基金申请] 面上函评意见出来了，像什么等级？ 20+4 Tsingking1 2026-08-27 17/850 2026-09-01 19:51 by 超级无敌华子
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +5 bjdxyxy 2026-08-26 5/250 2026-09-01 17:54 by 小伟大博士
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +13 Kittylucky 2026-08-27 14/700 2026-09-01 11:06 by feng6531
[基金申请] 麻烦专家们看看评委们的意见（F口面上） +7 gdd2018 2026-08-28 12/600 2026-09-01 08:32 by 尼古拉斯小虫
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +6 yuleib84 2026-08-26 7/350 2026-08-31 19:46 by 鱼翔浅底1
[基金申请] 面上意见出来了 +12 黄鸟于飞Chao 2026-08-29 23/1150 2026-08-31 18:57 by 黄鸟于飞Chao
[基金申请] 中青基了要发朋友圈吗？ +7 349506619 2026-08-28 7/350 2026-08-31 13:39 by 冼亮淀粉酶
[基金申请] 为什么到现在没收到通知？ +5 tannykie 2026-08-29 5/250 2026-08-30 21:05 by purplejack
[基金申请] 有没有仍没收到信息的 +7 德尚中行 2026-08-27 8/400 2026-08-30 20:52 by purplejack
[考博] 找导师 +6 yuanjiabao 2026-08-29 7/350 2026-08-30 14:40 by 生科新手
[基金申请] 我就是申请一个面上项目而已，这评审意见是按照杰青的条件评的吧？ +6 gouxfjh 2026-08-28 11/550 2026-08-30 07:57 by gouxfjh
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
[基金申请] 看板上这么多中的，有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭