应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 菌液PCR的结果显示：阳性克隆较少，且目的条带比较浅
131/2返回列表12下一页
查看: 3544  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

1297286362

铜虫 (初入文坛)

[求助] 菌液PCR的结果显示：阳性克隆较少，且目的条带比较浅 已有3人参与

我的步骤是：我用TAKARA的primerstar扩的PCR产物（877bp，高GC序列 98℃ 5min，98℃ 10s，68℃ 1min10s，30cycles，72 ℃ 10min，12℃ forever），跑胶看了一下，条带挺亮，然后纯化，用TAKARA的EX Taq加A（24.2ul DNA ,3ul 10×EX Taq BUFFER ，2.5ul 2.5mM dATP 0.3ul EX Taq 70℃ 30min）再进行纯化，按照北京全式金试剂盒的说明书进行TA克隆（5ul体系，37 ℃ 10min），然后转化（感受态细胞用的是试剂盒里自带的）涂板，37℃培养过夜，挑单菌落于10ul LB+AMP培养1h，取1ul菌液做模板用TAKARA的rTaq进行PCR（98℃ 5min ，98℃ 10s ，55℃ 30s， 72℃ 1min10s ，30cycles 72 ℃ 10min，12℃ forever ）,但是现在的问题是：不仅阳性克隆比较少，而且阳性克隆的目的条带比较浅。
备注：纯化以及转化步骤和大众的相同，菌液PCR跑出的胶图中可以看出：不仅阳性克隆比较少，而且阳性克隆的目的条带比较浅，选了几个单一条带的管号去测序，结果是好的，但我想知道为什么假阳性这么高，而且条带比较浅。希望各位帮帮忙！谢谢
回复此楼

» 本帖附件资源列表

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
喜欢你就诅咒你！
1楼 2015-08-29 11:57:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

1297286362

铜虫 (初入文坛)
亲们，我找到原因了，我的PCR产物是高GC序列，做菌液PCR时一般的酶扩增的效果不好，我使用了primeSTAR,效果非常好，如果遇到类似的 问题可以借鉴一下。
赞一下(2人) 回复此楼
喜欢你就诅咒你！
10楼2015-09-03 21:26:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by 1297286362 at 2015-09-03 21:26:05
亲们，我找到原因了，我的PCR产物是高GC序列，做菌液PCR时一般的酶扩增的效果不好，我使用了primeSTAR,效果非常好，如果遇到类似的 问题可以借鉴一下。

哎，其实问题都很简单，只是一个酶，有的时候做实验久了，往往就不喜欢考虑最简单的原因了~还是优化体系，摸索条件，扩增当然不要用普通的酶了，我们都用热启动酶，或者热启动高保真酶，你的模板GC含量高，当然更不选择一般的酶了，楼主有待了解更多的酶种类啊，选择，适用性等等
赞一下(1人) 回复此楼
todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
11楼2015-09-06 09:40:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-09-03 23:01:42
目的条带浅，好歹也出来啦，说明在摸索摸索条件优化优化就能出来了，至于假阳性问题，你是和正对照比出的结果吧？原因很多啊，模板有Taq酶抑制剂，引物设计不合理退火温度延伸时间等，你得自己一一排除啊，上张图上来可能会好分析一点，这些资料上多有的http://www.detaibio.com/topics/pcr-faq-specific-amplify.html
赞一下 回复此楼
todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
2楼2015-09-01 10:21:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiaomili1206

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-03 23:02:00
测序结果对的那几管菌液就是转化成功有目的基因的菌液，扩大培养，调整好细菌状态就可以保存菌种了。扩增阳性和测序正确，这不叫假阳性啊，这就是阳性结果了。英格恩技术博客。
赞一下 回复此楼
3楼2015-09-01 11:00:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

1297286362

铜虫 (初入文坛)
内容已删除
回复此楼
喜欢你就诅咒你！
4楼2015-09-02 16:37:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

1297286362

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xiaomili1206 at 2015-09-01 11:00:00
测序结果对的那几管菌液就是转化成功有目的基因的菌液，扩大培养，调整好细菌状态就可以保存菌种了。扩增阳性和测序正确，这不叫假阳性啊，这就是阳性结果了。英格恩技术博客。

亲，是我说错了，我想说的是空载率比较高，我做了几次都是这样，有母的条带的比较少，而且还有杂带，请问这是什么原因？
赞一下 回复此楼
喜欢你就诅咒你！
5楼2015-09-02 16:41:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

结果挺好的，很正常
胶底下有些引物二聚体之类的会影响PCR效率
一个就够用了，要那么多干什么
赞一下 回复此楼
The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
6楼2015-09-03 09:19:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Eternity宇

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
7楼2015-09-03 11:22:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

1297286362

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Eternity宇 at 2015-09-03 11:22:29
摇一小时，时间过短了，菌液浓度可能太低……

亲，我找见原因了，我的PCR产物是高GC序列，做菌液PCR时一般的酶扩增的效果不好，我使用了primeSTAR,效果非常好，同样谢谢您的关注！
赞一下 回复此楼
喜欢你就诅咒你！
8楼2015-09-03 21:24:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

1297286362

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2015-09-03 09:19:36
结果挺好的，很正常
胶底下有些引物二聚体之类的会影响PCR效率
一个就够用了，要那么多干什么

亲，我找到原因了，我的PCR产物是高GC序列，做菌液PCR时一般的酶扩增的效果不好，我使用了primeSTAR,效果非常好，同样谢谢您的关注！
赞一下 回复此楼
喜欢你就诅咒你！
9楼2015-09-03 21:25:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 1297286362 的主题更新
131/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的？ +17 爱看书的可乐 2026-08-26 19/950 2026-09-02 00:19 by xiangy672
[基金申请] 面上合作单位盖章 +6 ssyjh 2026-08-27 9/450 2026-09-01 20:01 by huagongfeihu
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +5 bjdxyxy 2026-08-26 5/250 2026-09-01 17:54 by 小伟大博士
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +13 Kittylucky 2026-08-27 14/700 2026-09-01 11:06 by feng6531
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +6 yuleib84 2026-08-26 7/350 2026-08-31 19:46 by 鱼翔浅底1
[基金申请] 面上意见出来了 +12 黄鸟于飞Chao 2026-08-29 23/1150 2026-08-31 18:57 by 黄鸟于飞Chao
[基金申请] 能否申诉？ +7 echo8914667 2026-08-30 8/400 2026-08-31 17:00 by yihongxu
[基金申请] 中青基了要发朋友圈吗？ +7 349506619 2026-08-28 7/350 2026-08-31 13:39 by 冼亮淀粉酶
[基金申请] 有没有仍没收到信息的 +7 德尚中行 2026-08-27 8/400 2026-08-30 20:52 by purplejack
[考博] 找导师 +6 yuanjiabao 2026-08-29 7/350 2026-08-30 14:40 by 生科新手
[基金申请] 我就是申请一个面上项目而已，这评审意见是按照杰青的条件评的吧？ +6 gouxfjh 2026-08-28 11/550 2026-08-30 07:57 by gouxfjh
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 (金币+15) +15 晴天加油 2026-08-26 16/800 2026-08-29 18:28 by symmetry
[基金申请] 国自然评审意见 +13 wangmingqi 2026-08-28 19/950 2026-08-29 10:22 by Poppy1104
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
[基金申请] 系统查不到 +11 董八千 2026-08-26 11/550 2026-08-28 18:06 by Leogzhya
[基金申请] 为什么 国际(地区)合作与交流项目 没有放榜？ 10+3 majunge000 2026-08-26 11/550 2026-08-27 08:42 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 国际合作可查了，中了面上 (EPI+1)(金币+50) +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 系统进不去 +4 yanglien 2026-08-26 5/250 2026-08-26 11:10 by wenfengw83
[基金申请] 项目信息和经费信息在系统里都可以看到了 +6 wittyboy 2026-08-26 14/700 2026-08-26 10:55 by wittyboy
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭