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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 菌液PCR的结果显示：阳性克隆较少，且目的条带比较浅
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1297286362

铜虫 (初入文坛)

[求助] 菌液PCR的结果显示：阳性克隆较少，且目的条带比较浅已有3人参与

我的步骤是：我用TAKARA的primerstar扩的PCR产物（877bp，高GC序列 98℃ 5min，98℃ 10s，68℃ 1min10s，30cycles，72 ℃ 10min，12℃ forever），跑胶看了一下，条带挺亮，然后纯化，用TAKARA的EX Taq加A（24.2ul DNA ,3ul 10×EX Taq BUFFER ，2.5ul 2.5mM dATP 0.3ul EX Taq 70℃ 30min）再进行纯化，按照北京全式金试剂盒的说明书进行TA克隆（5ul体系，37 ℃ 10min），然后转化（感受态细胞用的是试剂盒里自带的）涂板，37℃培养过夜，挑单菌落于10ul LB+AMP培养1h，取1ul菌液做模板用TAKARA的rTaq进行PCR（98℃ 5min ，98℃ 10s ，55℃ 30s， 72℃ 1min10s ，30cycles 72 ℃ 10min，12℃ forever ）,但是现在的问题是：不仅阳性克隆比较少，而且阳性克隆的目的条带比较浅。
备注：纯化以及转化步骤和大众的相同，菌液PCR跑出的胶图中可以看出：不仅阳性克隆比较少，而且阳性克隆的目的条带比较浅，选了几个单一条带的管号去测序，结果是好的，但我想知道为什么假阳性这么高，而且条带比较浅。希望各位帮帮忙！谢谢
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喜欢你就诅咒你！
1楼2015-08-29 11:57:02
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xiaomili1206

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-03 23:02:00

18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-09-03 23:01:42

1297286362

铜虫 (初入文坛)

fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

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