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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 重组质粒转化后提的平板有很多菌落，但是菌落PCR 没有结果。
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LeonardoChen

金虫 (小有名气)

[交流] 重组质粒转化后提的平板有很多菌落，但是菌落PCR 没有结果。 已有6人参与

重组质粒PET28a，转化到大肠杆菌（BL21），涂布到平板，37℃，培养14h左右，单菌落数有很多然后随机挑取10单菌落，加入50微升无菌水，煮沸40min，做菌落PCR，第一次pcr体系是：10微升buffer ，1微升Taq ，1微升dNTP MIX ，1微升T7引物 ，1微升T7Terminator  ，86微升无菌水。分装每管9微升，再加入1微升煮沸的菌液，进行PCR，跑胶结果显示有阳性克隆，但是测序结果显示都是假阳性。
第二次尝试用另一种方法：10微升buffer ，1微升Taq ，1微升dNTP MIX ，1微升T7Terminator  ，1微升引物R（就是自己刚开始做克隆设计的引物） ，86微升无菌水。分装每管9微升，再加入1微升煮沸的菌液，进行PCR，跑胶结果显示都没有阳性克隆。
PCR反应条件：95℃ 5min，Sample Text   72℃ 10min，4.0℃ pause

各位能不能帮我分析下，为什么单菌落那么多却没有阳性克隆，如果是实验操作的原因最可能会出现在哪一步？谢谢，不甚感激！
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1楼 2015-09-29 08:57:23
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
★
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你这对T7引物可能污染了，你用水做模板跑个PCR试试，看是不是能跑出条带出来。

没有阳性克隆说明你没有把片段连上去呗，如果是双酶切连接的话，可能质粒没有酶切干净。
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。
2楼2015-09-29 09:42:38
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董博士

金虫 (正式写手)
★
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有可能是没连上吧，可以用其他模板先试试你的PCR引物及程序问题，如果可以P出来，就说明是重组失败，我感觉如果转化后平板上菌落很多的话，很有可能好多都是自连的，一般平板菌落较少的话，出现阳性克隆的可能性会大，重新做连接吧
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医学&统计学
3楼2015-09-30 09:29:14
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
★
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注意做对照吧，菌落PCR，你挑的单克隆是已经经过筛选过的吗
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
4楼2015-09-30 10:38:31
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zliean

金虫 (小有名气)
★
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我最近也是pet28a转21斑长的很多 不过验证完没有   有时候在目的位置有奇形怪状的条带   然后果断提了质粒  再验证就有条带了   也搞不懂什么原因   你也可以随机挑几个提质粒试试

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5楼2015-10-16 16:24:30
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梁小昌

新虫 (初入文坛)
菌落PCR

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6楼2015-10-16 16:37:53
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wxb2061

银虫 (小有名气)
★
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我们没有做过菌落PCR，转化，就挑单菌落提质粒，然后酶切检测。不过在此，想知道，菌落PCR原理是什么？怎样确认连接与否！新生求告知，谢谢！

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走在途中……
7楼2015-10-16 17:36:01
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