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LeonardoChen金虫 (小有名气)
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重组质粒转化后提的平板有很多菌落，但是菌落PCR 没有结果。已有6人参与
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重组质粒PET28a，转化到大肠杆菌（BL21），涂布到平板，37℃，培养14h左右，单菌落数有很多然后随机挑取10单菌落，加入50微升无菌水，煮沸40min，做菌落PCR，第一次pcr体系是：10微升buffer ，1微升Taq ，1微升dNTP MIX ，1微升T7引物 ，1微升T7Terminator ，86微升无菌水。分装每管9微升，再加入1微升煮沸的菌液，进行PCR，跑胶结果显示有阳性克隆，但是测序结果显示都是假阳性。 第二次尝试用另一种方法：10微升buffer ，1微升Taq ，1微升dNTP MIX ，1微升T7Terminator ，1微升引物R（就是自己刚开始做克隆设计的引物） ，86微升无菌水。分装每管9微升，再加入1微升煮沸的菌液，进行PCR，跑胶结果显示都没有阳性克隆。 PCR反应条件：95℃ 5min，Sample Text 72℃ 10min，4.0℃ pause 各位能不能帮我分析下，为什么单菌落那么多却没有阳性克隆，如果是实验操作的原因最可能会出现在哪一步？谢谢，不甚感激！ |
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2楼2015-09-29 09:42:38
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3楼2015-09-30 09:29:14
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4楼2015-09-30 10:38:31
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我最近也是pet28a转21斑长的很多 不过验证完没有 有时候在目的位置有奇形怪状的条带 然后果断提了质粒 再验证就有条带了 也搞不懂什么原因 你也可以随机挑几个提质粒试试 发自小木虫Android客户端 |
5楼2015-10-16 16:24:30
6楼2015-10-16 16:37:53
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我们没有做过菌落PCR，转化，就挑单菌落提质粒，然后酶切检测。不过在此，想知道，菌落PCR原理是什么？怎样确认连接与否！新生求告知，谢谢！ 发自小木虫Android客户端 |
7楼2015-10-16 17:36:01