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yuminzorro

木虫 (小有名气)

[求助] 一个平板上挑取不同菌落得到的测序结果不一样

做克隆测序时,我将PCR产物切胶回收,连接转化到感受态细胞中,进行蓝白斑筛选后,一个平板上挑去3个单克隆,菌液PCR结果显示是阳性克隆,然后将菌液送去测序,但测序结果3个中只有一个是我的目的序列。求高手帮助解释一下!谢谢!
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shen_41745

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
yuminzorro: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-11-14 19:56:23
一是你用于扩展PCR的酶是高保真酶吗?二即使出现假阳性克隆也很正常啊,只要有正确的出来就行啦!
9楼2012-11-14 16:02:19
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普通回帖

yuminzorro

木虫 (小有名气)

在线等啊……
2楼2012-11-14 14:43:49
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xj0311

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
yuminzorro: 金币+2 2012-11-14 19:56:32
蓝白斑筛选经常会出现这样的情况,如果有酶切位点建议测序之前自己可以鉴定一下
3楼2012-11-14 14:51:54
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
yuminzorro: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-11-14 19:56:39
你如何确定自己的是阳性?PCR?这个不可信,没有酶切吧?
只有酶切正确的才是阳性,不然就会出现你这种情况,很明显,你送去测序的菌株里面有两个都是假阳性.
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
4楼2012-11-14 14:54:26
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yuminzorro

木虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by Marado at 2012-11-14 14:54:26
你如何确定自己的是阳性?PCR?这个不可信,没有酶切吧?
只有酶切正确的才是阳性,不然就会出现你这种情况,很明显,你送去测序的菌株里面有两个都是假阳性.

我没有进行酶切鉴定,直接对菌液进行扩增,电泳显示条带大小和我的目的产物大小一致啊。这样鉴定不行吗/
5楼2012-11-14 15:21:30
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

引用回帖:
5楼: Originally posted by yuminzorro at 2012-11-14 15:21:30
我没有进行酶切鉴定,直接对菌液进行扩增,电泳显示条带大小和我的目的产物大小一致啊。这样鉴定不行吗/...

不可以,起码是不准确~可以酶切的话一定要酶切!
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
6楼2012-11-14 15:29:06
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yuminzorro

木虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by Marado at 2012-11-14 15:29:06
不可以,起码是不准确~可以酶切的话一定要酶切!...

这样的话是不是要在我引物上设计酶切位点啊!
7楼2012-11-14 15:50:42
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shen_41745

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
这种现象很正常啊!!!
8楼2012-11-14 15:59:56
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by yuminzorro at 2012-11-14 15:50:42
这样的话是不是要在我引物上设计酶切位点啊!...

不需要,直接切载体自带酶切位点
Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
10楼2012-11-14 17:07:33
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