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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 一个平板上挑取不同菌落得到的测序结果不一样
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yuminzorro

木虫 (小有名气)

[求助] 一个平板上挑取不同菌落得到的测序结果不一样

做克隆测序时，我将PCR产物切胶回收，连接转化到感受态细胞中，进行蓝白斑筛选后，一个平板上挑去3个单克隆，菌液PCR结果显示是阳性克隆，然后将菌液送去测序，但测序结果3个中只有一个是我的目的序列。求高手帮助解释一下！谢谢！
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1楼2012-11-14 14:39:46
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

shen_41745

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
yuminzorro: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-11-14 19:56:23
一是你用于扩展PCR的酶是高保真酶吗？二即使出现假阳性克隆也很正常啊，只要有正确的出来就行啦！
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9楼2012-11-14 16:02:19
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普通回帖

yuminzorro

木虫 (小有名气)
在线等啊……
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2楼2012-11-14 14:43:49
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xj0311

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yuminzorro: 金币+2 2012-11-14 19:56:32
蓝白斑筛选经常会出现这样的情况，如果有酶切位点建议测序之前自己可以鉴定一下
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3楼2012-11-14 14:51:54
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yuminzorro: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-11-14 19:56:39
你如何确定自己的是阳性？PCR？这个不可信，没有酶切吧？
只有酶切正确的才是阳性，不然就会出现你这种情况，很明显，你送去测序的菌株里面有两个都是假阳性.
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4楼2012-11-14 14:54:26
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yuminzorro

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Marado at 2012-11-14 14:54:26
你如何确定自己的是阳性？PCR？这个不可信，没有酶切吧？
只有酶切正确的才是阳性，不然就会出现你这种情况，很明显，你送去测序的菌株里面有两个都是假阳性.

我没有进行酶切鉴定，直接对菌液进行扩增，电泳显示条带大小和我的目的产物大小一致啊。这样鉴定不行吗/
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5楼2012-11-14 15:21:30
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer
引用回帖:
5楼: Originally posted by yuminzorro at 2012-11-14 15:21:30
我没有进行酶切鉴定，直接对菌液进行扩增，电泳显示条带大小和我的目的产物大小一致啊。这样鉴定不行吗/...

不可以，起码是不准确~可以酶切的话一定要酶切！
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6楼2012-11-14 15:29:06
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yuminzorro

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Marado at 2012-11-14 15:29:06
不可以，起码是不准确~可以酶切的话一定要酶切！...

这样的话是不是要在我引物上设计酶切位点啊！
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7楼2012-11-14 15:50:42
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shen_41745

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这种现象很正常啊！！！
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8楼2012-11-14 15:59:56
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by yuminzorro at 2012-11-14 15:50:42
这样的话是不是要在我引物上设计酶切位点啊！...

不需要，直接切载体自带酶切位点
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10楼2012-11-14 17:07:33
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