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qaz139687

新虫 (小有名气)

[交流] 大家克隆一个基因的全长一般要多久啊

本人目前在做一个膜蛋白的基因，做了半年只拿到3 RACE的全长  是不是有些基因全长好拿点  有些不好拿啊
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jiqinger

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1楼 2015-06-26 10:29:52
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chgjzhyh

金虫 (小有名气)
★
qaz139687(金币+1): 谢谢参与
5‘race 试验比较复杂，所以需要的时间长一点儿，连续做也就一周时间。祝好运！
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2楼2015-06-26 10:35:56
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jiqinger

铁杆木虫 (正式写手)
★
qaz139687(金币+1): 谢谢参与
送红花一朵
是的
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6楼2015-06-26 11:26:12
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
★
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5‘端是麻烦些，尤其如果5’端有二级结构的。
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7楼2015-06-26 17:18:32
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ptttmt

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
OMG，你5端上回不是拿全了嘛？

[ 发自小木虫客户端 ]
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9楼2015-06-26 21:06:21
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qaz139687

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by ptttmt at 2015-06-26 21:06:21
OMG，你5端上回不是拿全了嘛？

另外一个基因 肾上腺素受体的。。 感觉有7个跨膜区的都好难做啊
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10楼2015-06-28 10:53:05
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qaz139687

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by stone2239 at 2015-06-26 17:18:32
5‘端是麻烦些，尤其如果5’端有二级结构的。

做的是G蛋白偶联受体，7次跨膜区的，是不是这种的都特别难做啊- -感觉好累
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11楼2015-06-28 10:53:55
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qaz139687

新虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by chgjzhyh at 2015-06-26 10:35:56
5‘race 试验比较复杂，所以需要的时间长一点儿，连续做也就一周时间。祝好运！

这么快啊 为啥我做半天老是不出蛋疼，按理论来说我觉得很好做出来的，但每次PCR后跑胶都是没结果，蛋都碎了
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12楼2015-06-28 10:55:30
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chgjzhyh

金虫 (小有名气)
★
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12楼: Originally posted by qaz139687 at 2015-06-28 10:55:30
这么快啊 为啥我做半天老是不出蛋疼，按理论来说我觉得很好做出来的，但每次PCR后跑胶都是没结果，蛋都碎了...

5·race 用tuchdown方法来跑，第一个PCR一般跑胶都没有结果，再跑一个巢式PCR应该就有你要的条带了。最后纯化克隆测序，就OK了
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13楼2015-06-28 16:05:55
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qaz139687

新虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by chgjzhyh at 2015-06-28 16:05:55
5·race 用tuchdown方法来跑，第一个PCR一般跑胶都没有结果，再跑一个巢式PCR应该就有你要的条带了。最后纯化克隆测序，就OK了...

你是用clontech 的race试剂盒做的吗
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14楼2015-06-29 12:14:17
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chgjzhyh

金虫 (小有名气)
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14楼: Originally posted by qaz139687 at 2015-06-29 12:14:17
你是用clontech 的race试剂盒做的吗...

invitrogen 的就可以了  pcr扩增就用普通的试剂盒就可以
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15楼2015-06-29 17:28:13
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qaz139687

新虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by chgjzhyh at 2015-06-29 17:28:13
invitrogen 的就可以了  pcr扩增就用普通的试剂盒就可以...

PCR扩增就拿普通PCR用的buffer dntp taq酶也可以扩出来吗
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16楼2015-06-29 20:08:51
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chgjzhyh

金虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by qaz139687 at 2015-06-29 20:08:51
PCR扩增就拿普通PCR用的buffer dntp taq酶也可以扩出来吗...

可以的
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17楼2015-06-30 00:41:32
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qaz139687

新虫 (小有名气)
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17楼: Originally posted by chgjzhyh at 2015-06-30 00:41:32
可以的...

昨天试了下，是可以扩出来，不过就是亮度特别暗，怎么调节程序或者体系呢？程序是自己根据引物设还是按照试剂盒里面的呢
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18楼2015-06-30 13:01:03
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chgjzhyh

金虫 (小有名气)
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18楼: Originally posted by qaz139687 at 2015-06-30 13:01:03
昨天试了下，是可以扩出来，不过就是亮度特别暗，怎么调节程序或者体系呢？程序是自己根据引物设还是按照试剂盒里面的呢...

根据自己的引物，以及按照每1kb/min 的扩增延伸时间来估计一下elongation的时间！
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19楼2015-06-30 21:41:39
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qaz139687

新虫 (小有名气)
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19楼: Originally posted by chgjzhyh at 2015-06-30 21:41:39
根据自己的引物，以及按照每1kb/min 的扩增延伸时间来估计一下elongation的时间！...

应该不是延伸时间的问题，我估算过大概1000以内，就设了1分钟
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20楼2015-07-01 09:55:27
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chgjzhyh

金虫 (小有名气)
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20楼: Originally posted by qaz139687 at 2015-07-01 09:55:27
应该不是延伸时间的问题，我估算过大概1000以内，就设了1分钟...

那就根据你的引物退火温度来设置Tuchdown 的退火温度最高不超过70℃
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21楼2015-07-01 11:01:42
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qaz139687

新虫 (小有名气)
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21楼: Originally posted by chgjzhyh at 2015-07-01 11:01:42
那就根据你的引物退火温度来设置Tuchdown 的退火温度最高不超过70℃...

比如退火温度60度，那就设置从68度开始每个循环减少0.5°，一直到60°，然后一直用60°循环？
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22楼2015-07-01 12:50:38
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dmbb3楼
2015-06-26 10:59   回复  
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xiejf4楼
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messengermu5楼
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qiaobethy8楼
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