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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 高GC含量目的基因的克隆
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berry94

铁虫 (初入文坛)

[求助] 高GC含量目的基因的克隆 已有14人参与

大家好，我要克隆一个1.2K的目的基因，GC含量70%，克隆了很长时间了，一直没有什么进展，特地来向前辈们求助。个人认为RNA提取应该是很好的，一直觉着反转录得不好，我用的promega A5000的反转录试剂盒，48度、50度反转过，都没有扩出条带，做RACE也没有得到结果，所以希望有经验者提下意见，让晚辈进步！
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实验快快出结果
1楼 2015-01-04 18:40:37
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回帖置顶 ( 共有1个 )

YANJL

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
berry94: 金币+3, ★★★很有帮助 2015-01-06 10:56:52
berry94: 回帖置顶 2015-01-06 10:57:02
我做的基因就是GC含量很高的，如果你怀疑反转录有问题，你可以用一段小一点的比较好P的引物来试一下能不能P出来，我P的时候都会加DMSO帮助解链，然后我感觉引物的设计也很重要，个人体会，用的两对引物，一对就怎么也p不出来，然后换了一对引物就很轻松的p出来了，用的GXL
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6楼2015-01-06 09:05:35
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titus0805

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回贴交流 2015-01-07 22:46:32
GC-buffer有两种，可以加DMSO和甘油，还有就是调退火温度，还可以做降落，反正各种条件一顿乱试，运气好点就p出来了
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15楼2015-01-07 11:46:07
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why025

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用GXL酶，专P GC含量高的
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18楼2015-01-07 16:43:36
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

GC含量那么高，而且又是1200bp的模板，普通酶应该扩增不出来，最好是使用专门用于长片段扩增的酶，也不要盲目的只选择高保真酶，毕竟高保真酶还是保真性居首位，不一定能对长片段的进行扩增啊。
对于高GC的模板，优化是一定不能少的，如果你购买的试剂盒中有直接是供高GC扩增的buffer的话，是最好的，这样就不用额外进行镁离子、DMSO的优化了，操作起来简单方便的，如果有热启动又长片段扩增的 最好不过了 （现在市场上极少极少的）
选酶是关键，buffer也是关键
希望有所帮助哦
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
19楼2015-01-08 11:51:37
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

可以在反转录之后，用内参基因检验一下你的cDNA质量。高GC含量扩增，最好使用GCbuffer，你用的PrimerSTAR，保真性很好，1.2Kb不算长。优化反应体系再试。
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20楼2015-01-08 15:22:07
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lanhongxia

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回贴交流 2015-01-07 22:44:47
有专门用于高GC含量的酶，可以承受较高温度的变性，延伸温度而不失活，楼主可以试一下。
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8楼2015-01-06 13:00:11
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loganfan

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回贴交流 2015-01-07 22:45:06
可以考虑加DMSO和甘油，或者使用GC buffer，我们做过一个也是70%的GC含量，倒是扩出来了，但总有几个位点是突变的，最后实在没办法，直接合成了
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10楼2015-01-06 16:47:43
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普通回帖

稻稻

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用的什么酶？个人认为酶是关键

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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做一个不动声色的人，不准情绪化，不准回头看。
2楼2015-01-04 20:40:19
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小刀188

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回贴交流 2015-01-07 22:44:24
加点GC—buffer再做一下，GC含量高很难克隆的
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3楼2015-01-05 09:12:45
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berry94

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 稻稻 at 2015-01-04 20:40:19
用的什么酶？个人认为酶是关键

宝生物的primestar酶，我觉得我反转的效果可能不好，大侠觉得promega的A5000 48度能反转出我的cDNA吗
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实验快快出结果
4楼2015-01-05 16:53:34
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berry94

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小刀188 at 2015-01-05 09:12:45
加点GC—buffer再做一下，GC含量高很难克隆的

我用的就是primestar with GC buffer 呢，您觉得我在反转上应该怎么做呢
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实验快快出结果
5楼2015-01-05 16:55:02
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berry94

铁虫 (初入文坛)
内容已删除
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实验快快出结果
7楼2015-01-06 10:52:00
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berry94

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by lanhongxia at 2015-01-06 13:00:11
有专门用于高GC含量的酶，可以承受较高温度的变性，延伸温度而不失活，楼主可以试一下。

谢谢，我用另的primestar ，应该可以不？请问你觉得我的反转录42度对于高GC会不会有问题？
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实验快快出结果
9楼2015-01-06 15:10:34
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