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berry94

铁虫 (初入文坛)

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性别: MM
专业: 细胞增殖、生长与分化

[求助] 高GC含量目的基因的克隆已有14人参与

大家好，我要克隆一个1.2K的目的基因，GC含量70%，克隆了很长时间了，一直没有什么进展，特地来向前辈们求助。个人认为RNA提取应该是很好的，一直觉着反转录得不好，我用的promega A5000的反转录试剂盒，48度、50度反转过，都没有扩出条带，做RACE也没有得到结果，所以希望有经验者提下意见，让晚辈进步！

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实验快快出结果

1楼 2015-01-04 18:40:37

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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

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专业: 抗体工程学

【答案】应助回帖

GC含量那么高，而且又是1200bp的模板，普通酶应该扩增不出来，最好是使用专门用于长片段扩增的酶，也不要盲目的只选择高保真酶，毕竟高保真酶还是保真性居首位，不一定能对长片段的进行扩增啊。
对于高GC的模板，优化是一定不能少的，如果你购买的试剂盒中有直接是供高GC扩增的buffer的话，是最好的，这样就不用额外进行镁离子、DMSO的优化了，操作起来简单方便的，如果有热启动又长片段扩增的最好不过了（现在市场上极少极少的）
选酶是关键，buffer也是关键
希望有所帮助哦