24小时热门版块排行榜    

查看: 3276  |  回复: 23

huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回贴交流 2015-01-07 22:45:33
这个酶有专用高GC buffer,可以试试,另外引物很重要,一定要设计好,RT一般不会有问题,除非你RNA降解严重。

[ 发自小木虫客户端 ]
11楼2015-01-06 17:06:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (正式写手)

感谢参与,应助指数 +1
本帖仅楼主可见
12楼2015-01-06 17:09:38
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

flyy1986

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我这儿有能在65度稳定工作的逆转录酶,超好用,可以试试。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
13楼2015-01-06 17:19:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回贴交流 2015-01-07 22:46:14
您好
扩增不出来,其实对于GC含量高的模板来说,主要是buffer要合适,普通的Taq酶的试剂盒只会有一种buffer,镁离子也是另外加进去的,或者还要在扩增的时候加入DMSO优化等等,这样很麻烦,扩增不出来,所以要先找到合适的buffer,购买的试剂盒中带有两种buffer,分别用于普通模板和高GC模板扩增。而且你用的宝生物的primestar,具有一定的保真性,最好不要用这个酶,扩增中它会将你的模板全部降解掉 所以电泳结束后没有条带。可以换成热启动Taq酶,不会降解模板和引物又能避免非特异性产物产生,个人使用过Relia热启动Taq聚合酶还是不错的,可以一试, http://www.biomart.cn/infosupply/19906627.htm
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
14楼2015-01-07 09:36:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

titus0805

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回贴交流 2015-01-07 22:46:32
GC-buffer有两种,可以加DMSO和甘油,还有就是调退火温度,还可以做降落,反正各种条件一顿乱试,运气好点就p出来了
15楼2015-01-07 11:46:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

titus0805

铁虫 (小有名气)

西门吹雪170: 屏蔽内容, 重复 2015-01-07 22:46:53
本帖内容被屏蔽

16楼2015-01-07 11:49:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wanglele87

金虫 (著名写手)

合成吧。也不长。

[ 发自小木虫客户端 ]
一生不羁放纵爱自由
17楼2015-01-07 12:28:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

why025

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
用GXL酶,专P GC含量高的
18楼2015-01-07 16:43:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

GC含量那么高,而且又是1200bp的模板,普通酶应该扩增不出来,最好是使用专门用于长片段扩增的酶,也不要盲目的只选择高保真酶,毕竟高保真酶还是保真性居首位,不一定能对长片段的进行扩增啊。
对于高GC的模板,优化是一定不能少的,如果你购买的试剂盒中有直接是供高GC扩增的buffer的话,是最好的,这样就不用额外进行镁离子、DMSO的优化了,操作起来简单方便的,如果有热启动又长片段扩增的 最好不过了 (现在市场上极少极少的)
选酶是关键,buffer也是关键
希望有所帮助哦
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
19楼2015-01-08 11:51:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

可以在反转录之后,用内参基因检验一下你的cDNA质量。高GC含量扩增,最好使用GCbuffer,你用的PrimerSTAR,保真性很好,1.2Kb不算长。优化反应体系再试。
20楼2015-01-08 15:22:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 berry94 的主题更新
信息提示
请填处理意见