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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 高GC含量目的基因的克隆
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回贴交流 2015-01-07 22:45:33
这个酶有专用高GC buffer,可以试试，另外引物很重要，一定要设计好,RT一般不会有问题，除非你RNA降解严重。

[ 发自小木虫客户端 ]
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11楼2015-01-06 17:06:00
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匿名

用户注销 (正式写手)
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12楼2015-01-06 17:09:38
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flyy1986

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我这儿有能在65度稳定工作的逆转录酶，超好用，可以试试。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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13楼2015-01-06 17:19:39
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回贴交流 2015-01-07 22:46:14
您好
扩增不出来，其实对于GC含量高的模板来说，主要是buffer要合适，普通的Taq酶的试剂盒只会有一种buffer，镁离子也是另外加进去的，或者还要在扩增的时候加入DMSO优化等等，这样很麻烦，扩增不出来，所以要先找到合适的buffer，购买的试剂盒中带有两种buffer，分别用于普通模板和高GC模板扩增。而且你用的宝生物的primestar，具有一定的保真性，最好不要用这个酶，扩增中它会将你的模板全部降解掉 所以电泳结束后没有条带。可以换成热启动Taq酶，不会降解模板和引物又能避免非特异性产物产生，个人使用过Relia热启动Taq聚合酶还是不错的，可以一试， http://www.biomart.cn/infosupply/19906627.htm
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
14楼2015-01-07 09:36:59
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titus0805

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回贴交流 2015-01-07 22:46:32
GC-buffer有两种，可以加DMSO和甘油，还有就是调退火温度，还可以做降落，反正各种条件一顿乱试，运气好点就p出来了
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15楼2015-01-07 11:46:07
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titus0805

铁虫 (小有名气)
西门吹雪170: 屏蔽内容, 重复 2015-01-07 22:46:53
本帖内容被屏蔽
16楼2015-01-07 11:49:21
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wanglele87

金虫 (著名写手)
合成吧。也不长。

[ 发自小木虫客户端 ]
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一生不羁放纵爱自由
17楼2015-01-07 12:28:14
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why025

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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用GXL酶，专P GC含量高的
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18楼2015-01-07 16:43:36
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

GC含量那么高，而且又是1200bp的模板，普通酶应该扩增不出来，最好是使用专门用于长片段扩增的酶，也不要盲目的只选择高保真酶，毕竟高保真酶还是保真性居首位，不一定能对长片段的进行扩增啊。
对于高GC的模板，优化是一定不能少的，如果你购买的试剂盒中有直接是供高GC扩增的buffer的话，是最好的，这样就不用额外进行镁离子、DMSO的优化了，操作起来简单方便的，如果有热启动又长片段扩增的 最好不过了 （现在市场上极少极少的）
选酶是关键，buffer也是关键
希望有所帮助哦
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
19楼2015-01-08 11:51:37
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

可以在反转录之后，用内参基因检验一下你的cDNA质量。高GC含量扩增，最好使用GCbuffer，你用的PrimerSTAR，保真性很好，1.2Kb不算长。优化反应体系再试。
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20楼2015-01-08 15:22:07
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