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berry94

铁虫 (初入文坛)

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性别: MM
专业: 细胞增殖、生长与分化

[求助] 高GC含量目的基因的克隆已有14人参与

大家好，我要克隆一个1.2K的目的基因，GC含量70%，克隆了很长时间了，一直没有什么进展，特地来向前辈们求助。个人认为RNA提取应该是很好的，一直觉着反转录得不好，我用的promega A5000的反转录试剂盒，48度、50度反转过，都没有扩出条带，做RACE也没有得到结果，所以希望有经验者提下意见，让晚辈进步！

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实验快快出结果

1楼 2015-01-04 18:40:37

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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

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专业: 抗体工程学

【答案】应助回帖

★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回贴交流 2015-01-07 22:46:14

您好
扩增不出来，其实对于GC含量高的模板来说，主要是buffer要合适，普通的Taq酶的试剂盒只会有一种buffer，镁离子也是另外加进去的，或者还要在扩增的时候加入DMSO优化等等，这样很麻烦，扩增不出来，所以要先找到合适的buffer，购买的试剂盒中带有两种buffer，分别用于普通模板和高GC模板扩增。而且你用的宝生物的primestar，具有一定的保真性，最好不要用这个酶，扩增中它会将你的模板全部降解掉所以电泳结束后没有条带。可以换成热启动Taq酶，不会降解模板和引物又能避免非特异性产物产生，个人使用过Relia热启动Taq聚合酶还是不错的，可以一试， http://www.biomart.cn/infosupply/19906627.htm