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berry94

铁虫 (初入文坛)

[求助] 高GC含量目的基因的克隆 已有14人参与

大家好,我要克隆一个1.2K的目的基因,GC含量70%,克隆了很长时间了,一直没有什么进展,特地来向前辈们求助。个人认为RNA提取应该是很好的,一直觉着反转录得不好,我用的promega A5000的反转录试剂盒,48度、50度反转过,都没有扩出条带,做RACE也没有得到结果,所以希望有经验者提下意见,让晚辈进步!
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titus0805

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回贴交流 2015-01-07 22:46:32
GC-buffer有两种,可以加DMSO和甘油,还有就是调退火温度,还可以做降落,反正各种条件一顿乱试,运气好点就p出来了
15楼2015-01-07 11:46:07
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why025

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
用GXL酶,专P GC含量高的
18楼2015-01-07 16:43:36
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

GC含量那么高,而且又是1200bp的模板,普通酶应该扩增不出来,最好是使用专门用于长片段扩增的酶,也不要盲目的只选择高保真酶,毕竟高保真酶还是保真性居首位,不一定能对长片段的进行扩增啊。
对于高GC的模板,优化是一定不能少的,如果你购买的试剂盒中有直接是供高GC扩增的buffer的话,是最好的,这样就不用额外进行镁离子、DMSO的优化了,操作起来简单方便的,如果有热启动又长片段扩增的 最好不过了 (现在市场上极少极少的)
选酶是关键,buffer也是关键
希望有所帮助哦
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
19楼2015-01-08 11:51:37
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

可以在反转录之后,用内参基因检验一下你的cDNA质量。高GC含量扩增,最好使用GCbuffer,你用的PrimerSTAR,保真性很好,1.2Kb不算长。优化反应体系再试。
20楼2015-01-08 15:22:07
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YANJL

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
berry94: 金币+3, ★★★很有帮助 2015-01-06 10:56:52
berry94: 回帖置顶 2015-01-06 10:57:02
我做的基因就是GC含量很高的,如果你怀疑反转录有问题,你可以用一段小一点的比较好P的引物来试一下能不能P出来,我P的时候都会加DMSO帮助解链,然后我感觉引物的设计也很重要,个人体会,用的两对引物,一对就怎么也p不出来,然后换了一对引物就很轻松的p出来了,用的GXL
6楼2015-01-06 09:05:35
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lanhongxia

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回贴交流 2015-01-07 22:44:47
有专门用于高GC含量的酶,可以承受较高温度的变性,延伸温度而不失活,楼主可以试一下。
8楼2015-01-06 13:00:11
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loganfan

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回贴交流 2015-01-07 22:45:06
可以考虑加DMSO和甘油,或者使用GC buffer,我们做过一个也是70%的GC含量,倒是扩出来了,但总有几个位点是突变的,最后实在没办法,直接合成了
10楼2015-01-06 16:47:43
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普通回帖

稻稻

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
用的什么酶?个人认为酶是关键

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
做一个不动声色的人,不准情绪化,不准回头看。
2楼2015-01-04 20:40:19
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小刀188

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回贴交流 2015-01-07 22:44:24
加点GC—buffer再做一下,GC含量高很难克隆的
3楼2015-01-05 09:12:45
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berry94

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 稻稻 at 2015-01-04 20:40:19
用的什么酶?个人认为酶是关键

宝生物的primestar酶,我觉得我反转的效果可能不好,大侠觉得promega的A5000 48度能反转出我的cDNA吗
实验快快出结果
4楼2015-01-05 16:53:34
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berry94

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 小刀188 at 2015-01-05 09:12:45
加点GC—buffer再做一下,GC含量高很难克隆的

我用的就是primestar with GC buffer 呢,您觉得我在反转上应该怎么做呢
实验快快出结果
5楼2015-01-05 16:55:02
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berry94

铁虫 (初入文坛)

内容已删除
实验快快出结果
7楼2015-01-06 10:52:00
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berry94

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by lanhongxia at 2015-01-06 13:00:11
有专门用于高GC含量的酶,可以承受较高温度的变性,延伸温度而不失活,楼主可以试一下。

谢谢,我用另的primestar ,应该可以不?请问你觉得我的反转录42度对于高GC会不会有问题?
实验快快出结果
9楼2015-01-06 15:10:34
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