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puddylee

新虫 (小有名气)

果断换酶啊

[ 发自小木虫客户端 ]
21楼2015-01-08 15:31:27
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berry94

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
17楼: Originally posted by wanglele87 at 2015-01-07 12:28:14
合成吧。也不长。

不能合成的,因为这是个未知基因,只是转录组测序得到的结果呢
实验快快出结果
22楼2015-01-14 10:44:37
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yunfengqing7

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

GC-buffer有两种,可以加DMSO和甘油,还有就是调退火温度,还可以做降落,反正各种条件一顿乱试,运气好点就p出来了

GC含量那么高,而且又是1200bp的模板,普通酶应该扩增不出来,最好是使用专门用于长片段扩增的酶,也不要盲目的只选择高保真酶,毕竟高保真酶还是保真性居首位,不一定能对长片段的进行扩增啊。
对于高GC的模板,优化是一定不能少的,如果你购买的试剂盒中有直接是供高GC扩增的buffer的话,是最好的,这样就不用额外进行镁离子、DMSO的优化了,操作起来简单方便的,如果有热启动又长片段扩增的 最好不过了 (现在市场上极少极少的)
选酶是关键,buffer也是关键
希望有所帮助哦
23楼2015-01-15 20:20:44
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快乐农夫

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

P高GC含量的,一般在反应体系中加入终浓度为4%左右的二甲基亚砜(DMSO),不过现在有公司生产专门P高GC含量产物的酶,他们已经给你加好了,而且优化的不错,你可以直接买来做。另外长片段扩增成功的关键是设计30个碱基以上的长引物,提高产物特异性,所以建议你把引物设计的长一点,使其退火温度达到60度以上甚至更高,然后两步法扩增(就是把退火和延伸压缩成一步进行,一边退火一边延伸),延伸温度由原来的72度改成你的引物退火温度
24楼2015-01-16 10:04:01
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