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berry94铁虫 (初入文坛)
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[求助]
高GC含量目的基因的克隆 已有14人参与
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| 大家好，我要克隆一个1.2K的目的基因，GC含量70%，克隆了很长时间了，一直没有什么进展，特地来向前辈们求助。个人认为RNA提取应该是很好的，一直觉着反转录得不好，我用的promega A5000的反转录试剂盒，48度、50度反转过，都没有扩出条带，做RACE也没有得到结果，所以希望有经验者提下意见，让晚辈进步！ |
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【答案】应助回帖
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GC-buffer有两种，可以加DMSO和甘油，还有就是调退火温度，还可以做降落，反正各种条件一顿乱试，运气好点就p出来了 GC含量那么高，而且又是1200bp的模板，普通酶应该扩增不出来，最好是使用专门用于长片段扩增的酶，也不要盲目的只选择高保真酶，毕竟高保真酶还是保真性居首位，不一定能对长片段的进行扩增啊。 对于高GC的模板，优化是一定不能少的，如果你购买的试剂盒中有直接是供高GC扩增的buffer的话，是最好的，这样就不用额外进行镁离子、DMSO的优化了，操作起来简单方便的，如果有热启动又长片段扩增的 最好不过了 （现在市场上极少极少的） 选酶是关键，buffer也是关键 希望有所帮助哦 |
23楼2015-01-15 20:20:44
2楼2015-01-04 20:40:19
3楼2015-01-05 09:12:45
berry94
铁虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
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- 虫号: 2877739
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- 性别: MM
- 专业: 细胞增殖、生长与分化
4楼2015-01-05 16:53:34