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DNA质粒的连接 已有1人参与
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DNA质粒连接是要注意什么问题啊？跪求各位大神告知 [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ] |
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xiatianli888
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2楼2015-06-12 07:26:53
恶魔的左眼
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- 专业: 蛋白质组学
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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这个东西网上一搜一大把。。。 1、连接反应的温度：DNA连接酶的最适反应温度为３７℃，但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是１２℃过夜。 2、DNA的平未端和粘性末端：由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。 二者连接效率不同。粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的。 3、 碱性磷酸酶处理质粒载体：为了提高连接效率，一般采取提高DNA的浓度，增加重组子比例。这样就会出现DNA自生连接问题， 为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。 4、连接反应的检测：连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确定。 5、如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效，可重新连接酶切后的λDNA。若连接成功，则说明有效。 |
3楼2015-06-12 10:15:07