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worm2010

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】请问大家：将外源DNA与载体连接的体系怎么确定啊？ 已有5人参与

将外源DNA与载体连接的体系怎么确定啊？我用TAKARA公司产的T4DNA连接酶，但是说明书上写的不太明确，什么DNA片段0.3pmol，载体DNA0.03pmol，这到底该怎么确定加多少μl？帮我出出主意，谢谢大家！
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1楼 2011-03-02 08:44:38
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丁丁猫

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
依我个人经验来说体系越小越好，我一般做5微升体系
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2楼2011-03-02 08:56:39
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worm2010

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 丁丁猫 at 2011-03-02 08:56:39:
依我个人经验来说体系越小越好，我一般做5微升体系

能详细说说吗？
还有为什么体系越小越好呢？
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3楼2011-03-02 09:04:25
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spiderboy

金虫 (正式写手)
★
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恩。同意沙发。。体系越小越好。一般5-10微升。。然后关键就是载体和外源DNA的比例，一般他们的分子数比例为1:3。。。所以你要对DNA和载体进行定量。。
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4楼2011-03-02 09:04:27
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worm2010

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by spiderboy at 2011-03-02 09:04:27:
恩。同意沙发。。体系越小越好。一般5-10微升。。然后关键就是载体和外源DNA的比例，一般他们的分子数比例为1:3。。。所以你要对DNA和载体进行定量。。

这个DNA和载体进行定量是怎么个定量法呀？
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5楼2011-03-02 09:07:56
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walker2898

银虫 (小有名气)
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翱宇(金币+1): 谢谢交流 2011-03-02 12:29:00
体系一般用10微升体系，具体构成得根据你的DNA和载体的浓度，测浓度可以电泳进行粗估，根据条带的亮度和marker的亮度进行比对确定浓度，一般载体和DNA的浓度比在1:3-1:8都可以，宝生物的一般T4DNA连接酶最好16度过夜连接，转化时加5微升即可。
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6楼2011-03-02 09:43:01
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nuoyaeva

铁杆木虫 (正式写手)
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lstt09nk(金币+1): 感谢交流 2011-03-02 18:03:09
...比如我用的Invitrogen的试剂盒，他给出的最佳mol比是10：1，然后你你根据你片段和载体的核苷酸数，算出你要加的ng数（根据说明书里的公式），再根据你片段的浓度算出体积数
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生活是美好的
7楼2011-03-02 12:48:03
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spiderboy

金虫 (正式写手)
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引用回帖:
Originally posted by worm2010 at 2011-03-02 09:07:56:
这个DNA和载体进行定量是怎么个定量法呀？

跑电泳。加上定量MARKER一起跑。。
然后拍照。。用专门的分析软件分析，如QUANTITY ONE
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8楼2011-03-02 18:52:23
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