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zzzjjj1986

木虫 (小有名气)

[求助] DNA与一个染料连接后如何鉴定？

求助！我用一条单链DNA氨基修饰后，与实验室自制的染料（带羧基），用EDC/NHS反应体系，想把单链DNA和染料连接上。跑高效硅胶板，出现了新的点，但是用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的时候，我的产物条带和对照组（氨基修饰的DNA)没有明显的区别。
1、染料是先溶于DMF里面，EDC/NHS活化，点板检测活化成功后，用TE稀释，加入DNA-NH2。避光室温反应。点板检测出现新点。
2、跑单链DNA的变性聚丙烯胺凝胶电泳的原理是什么？我的理想化是分子量不同跑的速度不同，电荷有没有影响？里面有DMF有没有影响？
3、还有没有其他方法可以鉴定两者连接上？
请教！！！！求助！！！！一直在这个问题上止步啊！
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1楼 2012-04-25 16:18:45
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zzzjjj1986

木虫 (小有名气)
都没有人知道吗
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2楼2012-04-25 16:26:51
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
3、还有没有其他方法可以鉴定两者连接上？
最简单的检测方法用连接前和连接后的DNA分子用质谱测定分子量变化。
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3楼2012-04-25 23:06:39
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
zzzjjj1986: 金币+5, 谢谢帮助 2012-04-26 10:17:44
3、还有没有其他方法可以鉴定两者连接上？
最简单的检测方法用连接前和连接后的DNA分子用质谱测定分子量变化。
具体参考文献：J.H.Banoub and Patrck A.Limbach edit,Mass spectrometry of Nuclesides and Nucleic Acids,CRC Press,2010.
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4楼2012-04-25 23:24:45
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zzzjjj1986

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 凌波丽 at 2012-04-25 23:24:45:
3、还有没有其他方法可以鉴定两者连接上？
最简单的检测方法用连接前和连接后的DNA分子用质谱测定分子量变化。
具体参考文献：J.H.Banoub and Patrck A.Limbach edit,Mass spectrometry of Nuclesides and Nucl ...

质谱我们学校打不出来的，分子量太大，8000多，学校的质谱仪只能到3，4千。并且我的样品量太少，毕竟DNA是从生物公司合成的。
我考虑过质谱，氢谱，还有红外光谱，我的实际情况都不太满足。
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5楼2012-04-26 10:21:14
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tian天笑

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zzzjjj1986: 金币+5, 谢谢回复 2012-04-26 18:56:23
zhaohq1209: 金币+2, 鼓励交流！ 2012-04-27 13:07:42
2. 核酸（RNA）的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它大分子的相互作用，
然后在电场作用下朝相反电极运动~

  离子的离子雾中的扩散双电层，离子尺寸越大、溶液中的离子强度越高时，电泳现象变得越明显。

     DMF本身不带电，溶于H+的溶液后，其中的酰胺基会与H+结合，可能会有影响
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每一次不经意的善举，都会让这个世界变得更好一点~
6楼2012-04-26 11:34:13
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zzzjjj1986

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by tian天笑 at 2012-04-26 11:34:13:
2. 核酸（RNA）的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它大分子的相互作用，
然后在电场作用下朝相反电极运动~

  离子的离子雾中的扩散双电层，离子尺寸越大、溶液中的离子强度越高时，电泳现象变得越明显。

   ...

我的是DNA ，我查了染料的结构，染料（分子量1000）是一种钠盐，水解后带有几个负电荷，所以电泳的时候，单独的染料会比我的溴酚蓝（分子量700左右）指示剂跑得快。但是DMF的影响在电泳中体现得不是很明显，不知道是不是染料的影响更大。
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7楼2012-04-26 18:59:29
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by zzzjjj1986 at 2012-04-26 10:21:14:
质谱我们学校打不出来的，分子量太大，8000多，学校的质谱仪只能到3，4千。并且我的样品量太少，毕竟DNA是从生物公司合成的。
我考虑过质谱，氢谱，还有红外光谱，我的实际情况都不太满足。

用限制性内切酶切断修饰前后的DNA，然后用MS就行了。
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8楼2012-04-26 23:00:47
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zzzjjj1986

木虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 凌波丽 at 2012-04-26 23:00:47:
用限制性内切酶切断修饰前后的DNA，然后用MS就行了。

质谱貌似都要毫克级别，我整个反应液里面是微克级别，买的东西1OD才33微克呢，打谱的各种方法都想过了，最大的难点在于我的量太少。还是谢谢你
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9楼2012-04-27 08:43:49
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★ ★ ★
zhaohq1209: 金币+3, 一并鼓励啦，呵呵~ 2012-04-27 13:07:31
那你只能先加大反应体系，再用质谱测定Mr，质谱是现在最敏感的检测手段了，不然考虑用电子透射显微镜或者原子力显微镜直接观测，原子力显微镜的轻敲可以直接对液相模式的生物分子表面直接观测。可以试试NMR，不过结晶X-ray diffraction就算了，太麻烦了。
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10楼2012-04-27 10:38:56
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