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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » DNA质粒的连接
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坏坏坏孩孩孩

新虫 (小有名气)

[求助] DNA质粒的连接 已有1人参与

DNA质粒连接是要注意什么问题啊？跪求各位大神告知

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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1楼 2015-06-11 23:07:57
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xiatianli888

金虫 (初入文坛)
顶一下，我也想知道

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2015-06-12 07:26:53
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个东西网上一搜一大把。。。
1、连接反应的温度：DNA连接酶的最适反应温度为３７℃，但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是１２℃过夜。
2、DNA的平未端和粘性末端：由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。 二者连接效率不同。粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的。
3、 碱性磷酸酶处理质粒载体：为了提高连接效率，一般采取提高DNA的浓度，增加重组子比例。这样就会出现DNA自生连接问题， 为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。
4、连接反应的检测：连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确定。
5、如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效，可重新连接酶切后的λDNA。若连接成功，则说明有效。
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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
3楼2015-06-12 10:15:07
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