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DNA质粒的连接 已有1人参与
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DNA质粒连接是要注意什么问题啊?跪求各位大神告知 [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ] |
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xiatianli888
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- 专业: 蛋白质组学
【答案】应助回帖
感谢参与,应助指数 +1
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这个东西网上一搜一大把。。。 1、连接反应的温度:DNA连接酶的最适反应温度为37℃,但在此温度下, 粘性末端的氢键结合很不稳定,折衷方法是12℃过夜。 2、DNA的平未端和粘性末端:由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端,因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。 二者连接效率不同。粘性末端效率高,因而在底物浓度,酶浓度选择上是有差异的。 3、 碱性磷酸酶处理质粒载体:为了提高连接效率,一般采取提高DNA的浓度,增加重组子比例。这样就会出现DNA自生连接问题, 为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理,除去其5’末端的磷酸基,防止环化, 通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。 4、连接反应的检测:连接反应成功与否,最后的检测要通过下一步实验,转化宿主菌, 阳性克隆的筛选来确定。 5、如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效,可重新连接酶切后的λDNA。若连接成功,则说明有效。 |

3楼2015-06-12 10:15:07














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