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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 探针法QPCR扩增曲线呈直线是什么原因
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在屋顶唱歌

铁虫 (初入文坛)

[求助] 探针法QPCR扩增曲线呈直线是什么原因 已有4人参与

最近做探针法的QPCR遇到了一个棘手的问题，求助高手指点。之前实验室用的是在生物公司买的试剂，扩的还不错，但是现在老板为了省钱，让我们自己配试剂做，结果惨不忍睹啊。相同的引物和探针，自己配的体系扩增曲线几乎是一条直线，并且起始荧光强度比对照高很多，不知道有没有相同经历的同学，求指点啊。

探针法QPCR扩增曲线呈直线是什么原因
Amplification Plot.jpg


探针法QPCR扩增曲线呈直线是什么原因-1
Multicomponent Plot.jpg
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1楼 2015-06-11 22:28:38
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

哎呀那个雨

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

楼主你问题现在解决没，我也是Taqman探针法，扩增曲线荧光值（Y轴值）特别大，而且也不是平滑的S型，更类似直线，不知道是什么原因。
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啊
9楼2015-08-24 19:45:49
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普通回帖

zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
在屋顶唱歌: 金币+1, ★有帮助 2015-06-13 12:49:23
公司的荧光定量相关的Master Mix都是经过反复测试过的，做过大量的工作，不是说按照常规的反应体系就能得到好的结果的。如果要自己配反应体系的话估计你需要花费几个月的时间去筛选哪种酶适合你的实验，并不是所有的酶都适合做荧光定量的。
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rainwater
2楼2015-06-12 11:24:51
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lssmttkl

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
在屋顶唱歌: 金币+1 2015-06-13 12:49:35
是这样的。最好买现成的酶来做。在酶同样的情况下出现这种问题，就是TM值没有摸索好吧。
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3楼2015-06-12 16:34:04
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在屋顶唱歌

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2015-06-12 11:24:51
公司的荧光定量相关的Master Mix都是经过反复测试过的，做过大量的工作，不是说按照常规的反应体系就能得到好的结果的。如果要自己配反应体系的话估计你需要花费几个月的时间去筛选哪种酶适合你的实验，并不是所有的 ...

我们验证了一下，不是酶的问题，影响大的是反应Buffer，现在不知道是Buffer中的哪种成分的影响，都不知道该怎么继续了
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4楼2015-06-13 12:31:10
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在屋顶唱歌

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lssmttkl at 2015-06-12 16:34:04
是这样的。最好买现成的酶来做。在酶同样的情况下出现这种问题，就是TM值没有摸索好吧。

现在酶是一样的，反应条件也一样，唯一不一样的就是Buffer。
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5楼2015-06-13 12:33:15
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 在屋顶唱歌 at 2015-06-13 12:31:10
我们验证了一下，不是酶的问题，影响大的是反应Buffer，现在不知道是Buffer中的哪种成分的影响，都不知道该怎么继续了...

用你的荧光定量的产物跑个琼脂糖胶看看有没有目的条带，看着荧光信号这么低。
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rainwater
6楼2015-06-15 11:38:31
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在屋顶唱歌

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zhangyunjing at 2015-06-15 11:38:31
用你的荧光定量的产物跑个琼脂糖胶看看有没有目的条带，看着荧光信号这么低。...

跑胶了，有条带，但是比买的Buffer产量低很多。
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7楼2015-06-15 12:16:56
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lssmttkl

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 在屋顶唱歌 at 2015-06-15 12:16:56
跑胶了，有条带，但是比买的Buffer产量低很多。...

那你们为什么不用买的BUFFER呢？我以前做的时候就是直接买的BIO-RAD一套东西，只需要自己摸索一下TM值就好了。
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8楼2015-07-24 15:47:08
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许彦

木虫 (正式写手)
很有可能是体系的问题。

[ 发自小木虫客户端 ]
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10楼2015-08-25 06:35:47
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