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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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kid冰猫

铜虫 (初入文坛)

[求助] WB非特异性条带 已有1人参与

最近做了几批western blot实验,每次显影都出现很多非特异性条带,而且亮度都和目的条带差不多,以前在相同的条件下膜都很干净的,现在完全不知道问题出在哪,请各位大神指教给点建议。这是我显影的图片,非特异性的膜是最近做的,最两边的是MARK,以前MARK也不会被显出来的,另一个是之前做的。

WB非特异性条带
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WB非特异性条带-1
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坚定不移往前走~~~~
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
WB非特异性带出现,最可能是脱脂牛奶封闭效果不好,建议使用新的脱脂牛奶,适当加长封闭时间;另外可能是一抗或者二抗清洗效果差,在两次清洗时,请增加清洗时间和清洗次数;还有可能目的蛋白质上样大了,适当减少上样量;还有一抗的专一性可能不够,或者稀释程度不够,换种一抗看看,可能放的时间久了也会有问题,尤其是反复冻融。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

2楼2015-06-11 17:39:26
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kid冰猫

铜虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by calorimetry at 2015-06-11 17:39:26
WB非特异性带出现,最可能是脱脂牛奶封闭效果不好,建议使用新的脱脂牛奶,适当加长封闭时间;另外可能是一抗或者二抗清洗效果差,在两次清洗时,请增加清洗时间和清洗次数;还有可能目的蛋白质上样大了,适当减少上 ...

首先,谢谢指教了
我用的封闭液是5%的BSA,我试过4℃封闭过夜,还是一样的;
我的蛋白上样量只有10ug,相对较少了,而且很疑惑的是之前都做出来了,就最近怎么做都做不出来;
你说的是抗体反复冻融有问题吗?会不会我的蛋白样品本身也有问题,可一般煮过的蛋白都比较稳定了?
坚定不移往前走~~~~
3楼2015-06-15 09:32:22
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你可以检测一下一抗的活性,我怀疑是一抗或者二抗的问题,或者封闭的问题。

如果蛋白质的抗原免疫簇改变,那么只是结合的特一性的一抗会改变,一般不会引起啊大量的非特异性的识别。而且因为SDS PAGE处理,WB中的蛋白质的抗原免疫簇应该主要是序列免疫决定簇,而不是空间免疫决定簇。所以如果真的是目的蛋白质本身出了问题,很可能是发生了降解或者外源性的蛋白质污染,SDS PAGE不一定都会把不同的蛋白质分离开,检测是否有外源蛋白质污染或者降解,只要测定一下原来成功时的目的蛋白质的红外和紫外光谱,这样样品也不会有损失。

蛋白质上样量过大也可能出现非特异性带。
4楼2015-06-15 13:23:04
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