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kid冰猫

铜虫 (初入文坛)

[求助] WB非特异性条带已有1人参与

最近做了几批western blot实验，每次显影都出现很多非特异性条带，而且亮度都和目的条带差不多，以前在相同的条件下膜都很干净的，现在完全不知道问题出在哪，请各位大神指教给点建议。这是我显影的图片，非特异性的膜是最近做的，最两边的是MARK，以前MARK也不会被显出来的，另一个是之前做的。

WB非特异性条带
4.jpg


WB非特异性条带-1
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坚定不移往前走~~~~
1楼2015-06-11 15:12:45
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
WB非特异性带出现，最可能是脱脂牛奶封闭效果不好，建议使用新的脱脂牛奶，适当加长封闭时间；另外可能是一抗或者二抗清洗效果差，在两次清洗时，请增加清洗时间和清洗次数；还有可能目的蛋白质上样大了，适当减少上样量；还有一抗的专一性可能不够，或者稀释程度不够，换种一抗看看，可能放的时间久了也会有问题，尤其是反复冻融。
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kid冰猫
2楼2015-06-11 17:39:26
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kid冰猫

铜虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by calorimetry at 2015-06-11 17:39:26
WB非特异性带出现，最可能是脱脂牛奶封闭效果不好，建议使用新的脱脂牛奶，适当加长封闭时间；另外可能是一抗或者二抗清洗效果差，在两次清洗时，请增加清洗时间和清洗次数；还有可能目的蛋白质上样大了，适当减少上 ...

首先，谢谢指教了
我用的封闭液是5％的BSA，我试过4℃封闭过夜，还是一样的；
我的蛋白上样量只有10ug，相对较少了，而且很疑惑的是之前都做出来了，就最近怎么做都做不出来；
你说的是抗体反复冻融有问题吗？会不会我的蛋白样品本身也有问题，可一般煮过的蛋白都比较稳定了？
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坚定不移往前走~~~~
3楼2015-06-15 09:32:22
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你可以检测一下一抗的活性，我怀疑是一抗或者二抗的问题，或者封闭的问题。

如果蛋白质的抗原免疫簇改变，那么只是结合的特一性的一抗会改变，一般不会引起啊大量的非特异性的识别。而且因为SDS PAGE处理，WB中的蛋白质的抗原免疫簇应该主要是序列免疫决定簇，而不是空间免疫决定簇。所以如果真的是目的蛋白质本身出了问题，很可能是发生了降解或者外源性的蛋白质污染，SDS PAGE不一定都会把不同的蛋白质分离开，检测是否有外源蛋白质污染或者降解，只要测定一下原来成功时的目的蛋白质的红外和紫外光谱，这样样品也不会有损失。

蛋白质上样量过大也可能出现非特异性带。
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4楼2015-06-15 13:23:04
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