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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 动植物 » 实验技术 » 拟南芥蛋白互作非特异条带怎么解决？
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wangdunzju

新虫 (小有名气)

[求助] 拟南芥蛋白互作非特异条带怎么解决？

各位虫友好！
最近在做拟南芥的蛋白互作时遇到问题，请教大家：
用拟南芥叶片液氮磨样，4度5000G离心5分后，用Pierce公司的Co-IP试剂盒做免疫共沉淀实验，完全按照说明书操作的，结果Control Gel（阴性对照组）中总是出现非特异性条带，样品组中的条带与Control Gel（阴性对照组）中的条带完全一样！按说阴性对照组里应该没有太明显的条带才对啊？但实际上Control Gel（阴性对照组）中的条带十分明显，就跟目的样品中的一个样，会不会是出厂时厂家把Control Gel装错了呢（感觉可能性不大）？尝试增加复合物的洗涤次数（到10次以上了）并且wash buffer 中有加入0.5%的triton X-100,都没有效果。而且样品也用Control Gel预处理了，都没能解决问题，阴性对照组的非特异性结合还是很强，这怎么办呢？急啊！！！

另外，抗体是兔抗血清，做Wb实验用过，特异性蛮好的。可以杂到43Kd的目的蛋白。

洗脱复合物的银染如图:


问题：
1，如何减少阴性对照中的非特异性结合？
2，看到的两个主带该不会是把抗体洗脱下来了吧？

拟南芥蛋白互作非特异条带怎么解决？
Co-IP.jpg
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1楼2014-03-27 15:36:36
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wangdunzju

新虫 (小有名气)
另外，洗脱的复合物中应该有诱饵蛋白的存在吗？我好像没有检测到，从银染图中没看到明显的43Kd目的带呦！
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2楼2014-03-27 15:38:48
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wangdunzju

新虫 (小有名气)
我有点怀疑这个53 Kd左右的带是不是 Rubisco蛋白，如果是的话，怎么降低它的干扰？
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3楼2014-03-27 15:40:06
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wangdunzju

新虫 (小有名气)
植物叶片中Rubisco 蛋白的量太大了，远远比目的基因的含量高得多，可能会干扰吧，不知道。
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4楼2014-03-27 16:00:20
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wangdunzju

新虫 (小有名气)
做过Co-IP的虫友帮忙诊断一下吧，谢谢了！
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5楼2014-03-28 08:54:09
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wangdunzju

新虫 (小有名气)
棘手案例，求解中！
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6楼2014-03-28 10:12:42
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wangdunzju

新虫 (小有名气)
自己顶一下，别沉下去了，求助啊！
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7楼2014-03-31 08:52:05
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cjin350625

新虫 (小有名气)
楼主用的Co-IP试剂盒与抗体的结合效率如何？
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8楼2015-06-23 10:44:35
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